核miRNA抑制TFEB介导的自噬
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-11-03
真人投注平台是至关重要的细胞器,负责降解蛋白质和受损细胞器以维持细胞稳态。转录因子EB(TFEB)是调节真人投注平台生物发生和自噬的主要转录因子...

    真人投注平台是至关重要的细胞器,负责降解蛋白质和受损细胞器以维持细胞稳态。转录因子EB(TFEB)是调节真人投注平台生物发生和自噬的主要转录因子。TFEB在细胞核中的功能是精细调节的,MiRNA是否参与TFEB的精密调节功能,今日揭晓答案。

技术路线:

结果:
1. 筛选与CLEAR结合的候选miRNA
    为调查核miRNA是否调节TFEB依赖的转录调节,将来自HEK293细胞的核RNA与含有TFEB的结合基序-CLEAR元素的DNA片段共孵育,通过下拉测定,TFEB与CLEAR元素结合。RNA测序检测下拉的核miRNA,并结合荧光素酶报告基因鉴定出miR-30b-5p使CLEAR荧光素酶报告基因活性减少46%,在真人投注平台生物发生基因的启动子上观察到与miR-30b-5p互补的基序。通过FRET分析验证miR-30b-5p和CTSD基因的DNA启动子片段之间的直接互动。总而言之,新型miRNA miR-30b-5p可以与CLEAR结合,抑制转录激活。

2. MiR-30b-5p抑制含有CLEAR元素基因的反式激活
    FISH检测显示miR-30b-5p位于细胞质和核。在miR-30b-5p敲除HEK293细胞中,TFEB在CLCN7,MCOLN1,CTSD和GLA 4个基因启动子片段上的富集增加,含有CLEAR元素的基因(例如CTSA,CTSD,MCOLN1和LAMP2)的活性在miR-30b-5p转染的细胞中减少,含有CLEAR元素的基因的mRNA水平在转染miR-30b-5p细胞中显著降低。si-Importin8介导成熟miRNA的细胞质至细胞核转运,导致核miR-30b-5p水平降低88%和miR-30b-5p对上述基因mRNA表达的抑制作用消失。这些结果证实miR-30b-5p抑制了细胞核中含CLEAR元件基因的转录激活。

3. 过表达miR-30b-5p抑制真人投注平台生物发生与自噬
    TFEB是调节真人投注平台生物发生和自噬的主要转录因子。转染miR-30b-5p的HEK293细胞中真人投注平台发生相关基因的表达被抑制,miR-30b-5p能减少营养剥夺或Torin1处理的真人投注平台基因蛋白质水平的增加。miR-30b-5p降低了经典的真人投注平台标记基因LAMP1和Lysotracker的荧光强度。这些结果表明过表达miR-30b-5p抑制了真人投注平台的生物发生。真人投注平台生物发生是自噬真人投注平台途径中不可缺少的一个过程,TFEB也调节自噬相关基因的表达。与巴氟霉素A1共处理,miR-30b-5p转染的细胞LC3-II水平降低,miR-30b-5p可抑制自噬体和真人投注平台的融合。以上表明miR-30b-5p抑制了自噬体的生物发生,以及自噬体-真人投注平台融合。

4. 敲除内源性miR-30b-5p升高真人投注平台生物发生和自噬
    真人投注平台生物发生和自噬基因的蛋白质水平在miR-30b-5p基因敲除HEK293中上调,与EBSS或Bafilomycin A1共使用时,上述基因的增加更为显著。LAMP1和Lysotracker以及串联EGFP-mCherry-LC3探针证实了内源性miR-30b-5p和自噬真人投注平台过程之间的关系。

5. miR-30b-5p对真人投注平台过程和自噬的抑制作用依赖TFEB
    Mut-miR-30b-5p(CLEAR的潜在结合位点被突变)逆转了miR-30b-5p对TFEB转录活性的抑制作用。此外,真人投注平台和自噬相关基因的mRNA和蛋白质水平不受Mut-miR-30b-5p影响。miR-30b-5p过表达细胞中,抑制TFEB挽救了真人投注平台和自噬相关基因的萤光素酶活性和mRNA水平的降低,TFEB的过表达可以部分挽救miR-30b-5p的上述抑制作用。这些数据表明,TFEB对miR-30b-5p介导的真人投注平台生物和自噬的抑制是必不可少的。

6. miR-30b-5p对小鼠肝脏自噬真人投注平台过程的调控
    进一步探索miR-30b-5p在体内的功能,通过尾静脉将重组腺病毒注射到小鼠中,禁食48小时以诱导小鼠肝脏中真人投注平台生物发生和自噬,在肝脏中证实过表达成熟的miR-30b-5p,导致TFEB和真人投注平台生物发生基因的启动子pol II的富集减少,LAMP1和LC3-II蛋白降低,SQSTM1 / p62蛋白增加。这些结果显示miR-30b-5p抑制了饥饿引起的自噬真人投注平台过程。

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