Mydgf促进心肌细胞增殖和新生心脏再生
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-08-14
骨髓源性生长因子(Mydgf)是一种由骨髓源性单核细胞和巨噬细胞分泌的旁分泌蛋白,在成年真人投注网站心肌梗死(MI)后具有抗心肌损伤的作用...

    骨髓源性生长因子(Mydgf)是一种由骨髓源性单核细胞和巨噬细胞分泌的旁分泌蛋白,在成年真人投注网站心肌梗死(MI)后具有抗心肌损伤的作用。因此小编为大家介绍发表于“Theranostics”杂志的文章“Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration”,给大家介绍Mydgf与心脏再生。

    在本研究中,我们发现心肌损伤后,Mydgf在新生真人投注网站心脏中被显著诱导。Mydgf缺乏阻碍心肌细胞(CM)增殖和心脏再生。Mydgf重组蛋白对CM的体内外增殖均有促进作用。RNA测序鉴定c-Myc/FoxM1通路介导Mydgf的促增殖作用。Mydgf治疗可促进心肌梗死后成年真人投注网站CM增殖和心脏再生,提示Mydgf可能是心肌损伤恢复的有效再生因子。
结 果:

1.Mydgf是在新生心脏再生过程中被诱导的
    我们采用qRT-PCR和western-blot检测野生型真人投注网站出生后心脏发育过程中Mydgf的表达。我们发现Mydgf在出生后第4天(P4)略有增加,然后随着年龄的增长逐渐降低(图1A-D)。为了研究Mydgf是否参与了新生心脏再生,我们对P1心脏进行了根尖切除术(AR),并测量了Mydgf在切除后不同时间点的表达(图1E)。Western blot和qRT-PCR显示,Mydgf表达在切除后1、4、7、14和21天显著增加(图1F-H)。接着,为了确定心脏再生过程中产生Mydgf的细胞类型,我们在AR后使用流式细胞术对巨噬细胞(MΦs)、CMs和内皮细胞(ECs)进行分类,并通过qRT-PCR验证三个细胞群的纯度。我们发现,在1dpr时,Mydgf主要由ECs而不是MΦs表达(图1I)。此外,我们还构建了Mydgf-EGFP真人投注网站,包括连接体EGFP和左(1302bp)和右(1765bp)2条同源臂,以研究Mydgf的合成。免疫组化显示EGFP与CDH5+细胞共定位,CDH5+细胞是ECs在7dpr时的标记,提示ECs是新生儿心脏损伤后的主要细胞类型(图1J)。

2.Mydgf是心脏再生和CM增殖所必需的
    我们对P1-Mydgf-KO真人投注网站进行了AR,并评估了心脏再生。Masson染色分析显示,与WT真人投注网站相比,Mydgf KO真人投注网站在21 dpr时的纤维化显著增大,再生能力显著降低(图2A-B)。超声心动图显示,与WT真人投注网站相比,Mydgf KO真人投注网站在21 dpr时心脏功能更差(图2C-D),表明Mydgf是心脏再生所必需的。心脏再生反应的中心特征是损伤后CM增殖的激活。我们在P1 Mydgf-KO真人投注网站上进行AR手术,并在7 dpr时,通过免疫荧光检测有丝分裂标记物磷酸化组蛋白3(pH3)、Ki67和Aurora B(Aurkb)(图2E)。我们发现Mydgf缺乏对AR损伤后CM的增殖是有害的(图2F-K)。最后,我们用共焦显微镜测定了CM倍体,这使得单个CM细胞核中DNA含量的定量成为可能(图2L)。以非CMs作为二倍体(2N)细胞核的参照物,Mydgf-KO-CM细胞核在14 dpr的双核CMs中2N核减少了40%,多倍体(4N和>4N)增加了30%(图2M),表明Mydgf缺乏减少了核分裂,从而增加了倍性。

3.Mydgf足以促进CM增殖和心脏再生
    为了研究Mydgf是否能刺激CM增殖,我们从WT真人投注网站中分离出新生的原发性CMs,并用Mydgf重组蛋白处理(图3A)。免疫荧光染色显示,与PBS组相比,Mydgf处理的CMs在16小时后pH3+、Ki67+和Aurkb+CMs显著增加(图3B-G),表明Mydgf促进CM体外增殖。
    我们将Mydgf重组蛋白微注射到Mydgf- KO P1真人投注网站AR损伤后的心肌中(图3H)。Masson染色和超声心动图分析表明,用Mydgf处理的Mydgf- KO真人投注网站表现出完全的心脏再生(图3I-J)和收缩功能障碍的增强(图3K-L)。我们还通过免疫荧光染色检测7dpr处CM增殖,发现在7dpr时CM增殖显著增强(图3M-R)。这些结果表明,Mydgf能促进CM的体内增殖,促进心脏损伤后新生心脏的再生。

4.Mydgf通过c-Myc/FoxM1途径控制CM增殖
    我们利用RNA测序研究了Mydgf处理的新生真人投注网站的基因表达谱(图4A),发现在Mydgf治疗16小时后,共有1005个基因差异表达,包括298个下调基因和707个上调基因。通过KEGG对上调基因的分析显示细胞周期和PI3K-Akt信号通路的显著富集。Western blot显示Mydgf处理的CMs中细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、CDK1和CDK6以及Akt(Ser473)的磷酸化(p)明显增加(图4B)。Mydgf-和PBS处理的CMs之间的细胞周期基因热图如图4C所示。我们发现Mydgf处理的CMs中FoxM1和Myc显著增加(图4D)。此外,我们还发现,与假手术对照组相比,在4和7dpr时,野生型真人投注网站心肌中的c-Myc和FoxM1均增加(图4E)。最后,我们还对新生的Mydgf-KO和WT真人投注网站进行了AR手术。Western blot显示,Mydgf缺乏可降低4 dpr和7 dpr的p-Akt、c-Myc和FoxM1的表达(图4F),表明c-Myc和FoxM1在心脏再生中不可或缺。
    FoxM1和c-Myc都被确定为促增殖因子。我们发现,Mydgf诱导的CM增殖分别通过敲除Akt、c-Myc或FoxM1(图4G-L)而显著抑制。Western blot显示Akt抑制剂LY294002、siRNA-c-Myc和siRNA-FoxM1可以抑制Mydgf诱导的p-Akt、Cyclin B1、Cyclin D1和CDK1的激活(图4M)。我们还发现,Akt敲除抑制了c-Myc和FoxM1的表达,而c-Myc的敲除阻断了FoxM1的表达,而FoxM1的敲除对Akt和c-Myc没有影响(图4M),表明Akt介导的Mydgf通过c-Myc/FoxM1途径诱导CM增殖。

5.Mydgf促进成年真人投注网站心脏再生
    为了验证Mydgf在成年真人投注网站中的功能,我们建立了心肌梗死(MI)真人投注网站模型。我们将Mydgf重组蛋白微量注射到心肌梗死后的WT成年真人投注网站心脏中,然后连续尾静脉注射7天(图5A)。Masson染色和超声心动图分析显示,在21 dpi时,Mydgf处理的心脏显示梗死面积减小(图5B-C),并且出现不太明显的收缩功能障碍(图5D-E)。Mydgf处理的真人投注网站与显著的生存效益相关(图5F)。免疫荧光染色显示Mydgf处理的真人投注网站在7dpi时CM增殖增加(图5G-L)。这些结果表明,Mydgf可促进成年真人投注网站心肌梗死后心脏再生和CM增殖,提示Mydgf可能是逆转心肌重构和预防心力衰竭的有效靶点。

结 论:
    Mydgf通过激活c-Myc/FoxM1通路促进心肌细胞增殖,促进新生和成年真人投注网站心脏损伤后的心脏再生,为逆转心脏重构和心力衰竭提供了一个潜在的靶点。


 


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