肾细胞癌中常规思路的10分文章详览
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-07-23
肾细胞癌(RCC)是泌尿外科中导致患者死亡的第二大肿瘤,仅在2018年就有约403426个新增病例...

    肾细胞癌(RCC)是泌尿外科中导致患者死亡的第二大肿瘤,仅在2018年就有约403426个新增病例。但是其治疗始终没有非常乐观的进展。circRNA在许多疾病中被证实具有调控作用,并可作为治疗靶标,但是在RCC中的作用尚不清楚。本文旨在探究RCC中是否存在某个关键circRNA参与调控了RCC的恶性进展,并于今年6月5日新近发表在《Molecular Cancer》(IF:10.679)期刊上。
结 果:
1、CircTLK1在RCC组织中过真人投注并于其不良预后有关
    通过肾上皮细胞和RCC细胞测序获得差异真人投注序列,Fig. 1a是最显著差异的10个circRNA。CircTLK1不仅在RCC细胞系和RCC组织中高真人投注,在术后转移中RCC病人中也高真人投注,并预示着不良预后(Fig. 1b-f)。CircTLK1长247nt,包含两个外显子,不可被RNase R消化(Fig. 1g-i)。

图1 CircTLK1在RCC组织中过真人投注并于其不良预后有关

2、敲除circTLK1抑制RCC细胞增殖
    shRNA-2可显著抑制三种细胞系中circTLK1的真人投注,但对TLK1的真人投注没有影响(Fig.a-c)。此外,使用shRNA-2干扰掉circTLK1的真人投注后RCC细胞的增殖能力显著下降。

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2敲除circTLK1抑制RCC细胞增殖

3、敲除circTLK1抑制RCC细胞迁移和侵袭

    如图3a-c所示,shRNA-2干扰circTLK1的真人投注后RCC细胞的迁移和侵袭能力显著下降。鉴于这种影响,作者进一步检测了上皮间质转化相关分子的真人投注,结果表明在circTLK1沉默的细胞中,间质标记物N-cadherinvimentin真人投注明显下降,而上皮标记物E-cadherin真人投注在circTLK1抑制的细胞中升高(图3e)。

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3敲除circTLK1抑制RCC细胞迁移和侵袭

4circTLK1作为miR-136-5p海绵

    为分析circTLK1的分子途径,使用FISH和核质分离实验来检测circTL1K的亚细胞定位,结果显示主要分布在细胞质(Fig.4a-b),这暗示着circTLK1可能通过捕获miRNA释放其靶基因转录本发挥功能。在线预测获得5个可与circTL1K结合的miRNA,然后生物素circTL1K探针在RCC细胞中显著下拉circTLK1,而miR-136-5p是惟一被生物素circTL1K探针下拉的miRNAFig.4c-d)。之后荧光素酶实验进一步证实两者间的作用关系(Fig.4e-f)。然而,过真人投注或敲除circTL1KRCC细胞中miR-136-5p的真人投注没有影响(Fig.4i-j)。这些表明circTLK1miR-136-5p起海绵吸附作用。


图4 circTLK1作为miR-136-5p海绵

5miR-136-5p通过靶向CBX4促进RCC进展

    在线预测miR-136-5p的靶基因有CBX4GNASLUZP6MSL2MTMR4SOCS7Fig 5a),并进一步通过综合转录分析发现miR-136-5pCBX4的真人投注呈现负相关(Fig 5b)。荧光素酶实验显示共转染miR-136-5p与野生型CBX4质粒后荧光素酶活性显著升高,而转染突变型CBX4则没有变化(Fig 5c-d)。过真人投注miR-136-5p抑制了CBX4mRNA和蛋白质水平(Fig 5e-g)。这些表明miR-136-5p直接靶向CBX4。此外,CBX4RCC组织中上调真人投注,且与肿瘤大小和术后转移呈正相关(Fig 5i-j)。RCC病人中高真人投注CBX4具有较低的总体生存率(Fig 5k)。

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5 CBX4miR-136-5p的直接靶点

6CBX4敲除抑制细胞增殖,迁移和侵袭

    如图6所示,使用shRNA干扰CBX4真人投注后,ACHN 769-P细胞系的增殖,集落形成,迁移和侵袭能力都显著下降。此外,CBX4的真人投注与VEGFA的真人投注呈正相关,shRNA干扰CBX4真人投注后VEGFA的真人投注显著抑制。

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6 CBX4敲除抑制细胞增殖,迁移和侵袭

7、过真人投注CBX4逆转了circTLK1对细胞增殖和转移的抑制作用

    为了探究circTLK1是否通过调控CBX4的真人投注改变肿瘤细胞的生物学功能,作者做了一个circTLK1CBX4的拯救实验。如图7所示,敲除circTLK1明显抑制了CBX4mRNA和蛋白质水平。CBX4过真人投注显著扭转了circTLK1诱导的肿瘤细胞的增殖抑制作用。在细胞的迁移,侵袭,集落形成实验中得出了一致的结果。上述表明circTLK1是通过调控CBX4的真人投注改变肿瘤细胞的生物学功能。

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7过真人投注CBX4逆转了circTLK1对细胞增殖和转移的抑制作用

8circTLK1敲低可抑制体内RCC细胞的生长和转移

    为了探究在体内circTLK1RCC肿瘤生长和肺转移的作用,构建了稳定的转染了shcircTLK1769-P细胞并注射到裸鼠中从而构建裸鼠肿瘤移植及肺转移模型。在肿瘤异种移植模型中,与shNC相比,shcircTLK1的小鼠肿瘤明显更小,肿瘤的体积和和肿瘤也都显著下降(Fig. 8a-c)。此外,shcircTLK1小鼠体内的Ki67CBX4VEGFA的真人投注水平显著下降(Fig. 8d-e)。在肺转移裸鼠模型中,shcircTLK1小鼠的肺转移显著减少(Fig. 8f-h)。在肿瘤异种移植模型中,过真人投注CBX4逆转了shcircTLK1诱导的生长抑制(Fig. 8i-k)。这些体内实验结果表明circTLK1可能在促进RCC的体内生长和转移中发挥重要作用。

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8 circTLK1敲低可抑制体内RCC细胞的生长和转移

    总之,作者证明了circTLK1通过海绵吸附miR- 136-5p来调节CBX4的真人投注,从而促进了RCC的生长和转移(8l)

参考文献:

    Li Jianfa., Huang Chenchen., Zou Yifan., Ye Jing., Yu Jing., Gui Yaoting.(2020). CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol. Cancer, 19(1), 103. doi:10.1186/s12943-020-01225-2

 



 


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