CircTLK1,肾真人投注癌新的预后标志物和治疗靶点?
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-07-13
circRNA主要存在于真人投注质或外泌体中,具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征....

    circRNA主要存在于真人投注质或外泌体中,具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征。大量研究表明circRNA通过调控真人投注生长、分化、迁移、侵袭以及调亡等多种生物学过程参与了癌症的发展,并预测了其在疾病诊断和治疗标志物等方面的应用前景。目前对circRNA的生物学功能和调控机制还知之甚少。近期北京大学深圳医院泌尿研究所的桂耀庭团队描述circTLK1在肾癌真人投注(RCC)中的表达特征,并分析和阐述了其与miR-136-5p/CBX4的ceRNA调控机制如何影响RCC真人投注的增殖、迁移、侵袭以及转移的。该研究表明circTLK1可能成为RCC的预后标志物和治疗靶点。相关研究结果以“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”为题发表在Molecular Cancer杂志上,杂志影响因子15.302。
背 景:
    
大量研究证明circRNA是肿瘤发生和进展的可能生物标记物和重要的调控因子。然而circRNA在RCC中的作用很大程度上仍然是未知的。
材 料:
    
RCC组织和正常肾组织,人RCC真人投注系,人肾上皮真人投注真人投注系,小鼠动物模型。
方 法:
   
circRNA-seq,shRNA,RNase R实验,CCK-8 assay,colony-formation assay,真人投注划痕实验, transwell,FISH,RNA pull-down,荧光素酶报告基因实验,WB,免疫荧光,免疫组化。
结 果:
    
发现circTLK1在RCC中表达上调,其表达与远处转移和不良预后呈正相关。circTLK1沉默可显著抑制RCC在体内外的增殖、迁移和侵袭。circTLK1主要分布在真人投注质中,作为miR-136-5p的海绵正向调控CBX4表达。CBX4过表达能逆转circTLK1沉默诱导的RCC真人投注表型抑制。因此,circTLK1通过作为miR-136-5p的海绵调控CBX4表达的方式在RCC发展中起重要作用。
研究思路:

1.筛选和鉴定RCC中高表达的circRNA
    circRNA已被证明在肿瘤发生、发展过程中有重要作用。作者通过RNA-seq筛选了在RCC真人投注中与正常肾上皮组织真人投注高度差异表达的circRNA(a)。通过生信分析和qPCR验证发现circTLK1在RCC真人投注中上调最明显,在RCC组织和术后转移的RCC病人中高表达,并与RCC患者总生存率和无进展生存率呈负相关(b-e)。Sanger鉴定和RNase R实验验证了circTLK1的环状结构(g,i)。

2.circTLK1敲除抑制RCC真人投注的增殖、迁移和侵袭
    确定circTLK1的表达特征和结构后,接下来探究circTLK1在RCC真人投注中的具体作用。利用ShRNA抑制circTLK1在RCC真人投注系中的表达,发现并不改变TLK1的表达(a-c);CCK8和克隆形成实验验证RCC真人投注的增殖受到抑制(d-f)。

    利用真人投注划痕实验和transwell发现在circTLK1敲除后,RCC真人投注的迁移和侵袭受到抑制(a-d)。说明circTLK1参与RCC真人投注的增殖、迁移和侵袭过程。

3.circTLK1的海绵基因鉴定
    真人投注定位决定基因的功能方向,利用FISH和核质分离PCR确定circTLK1定位于真人投注质(a-b),推测它可能是作为miRNA的海绵发挥功能。通过生物信息学分析筛选5个可能结合的miRNA,利用RNA pull-down和荧光素酶报告实验确定与circTLK1结合的miRNA是miR-136-5p(c-f),且敲除和过表达实验验证circTLK1和miR-136-5p互不改变彼此的表达(f-j),说明circTLK1对miR-136-5p具有海绵的作用。

4.miR-136-5p的下游靶基因CBX4的鉴定以及CBX4对RCC真人投注增殖、迁移和侵袭的影响
    通过生物信息学筛选了miR-136-5p可能的靶基因(a),其中CBX4的表达与miR-136-5p呈负相关(b)。荧光素酶报告基因实验验证与miR-136-5p结合的是CBX4 (c-d),且miR-136-5p过表达抑制CBX4的表达(e-g)。此外,CBX4在RCC组织中表达是上调的,并与肿瘤大小、术后转移呈正相关,与RCC患者总生存率呈负相关(h-k)。

    敲除CBX4(a),通过CCK-8、克隆形成、真人投注划痕、transwell等实验验证了CBX4沉默抑制了RCC真人投注的增殖、迁移和侵袭(b-i),同时发现CBX4的敲除抑制VEGFA的表达(j-K)。说明CBX4是miR-136-5p的靶基因,并参与调控RCC真人投注的增殖、迁移和侵袭过程。

5.过表达CBX4可逆转circTLK1沉默导致的真人投注增殖和转移抑制的影响
    为了研究CBX4与circTLK1的相互作用,作者敲除circTLK1,WB检测发现CBX4的表达显著性被抑制(a,b),过表达CBX4,发现其可以逆转circTLK1沉默诱导的RCC真人投注增殖、迁移和侵袭抑制作用(c-K)。证明circTLK1/miR-136-5p/CBX4之间存在ceRNA调控机制,该机制参与调控RCC真人投注增殖、迁移和侵袭过程。

6.circTLK1敲除抑制小鼠模型中RCC真人投注的生长和转移
    为了探究circTLK1在体内对RCC真人投注生长和转移的作用,构建了shcircTLK1和shNC异种移植肿瘤和肺转移小鼠模型。研究发现,circTLK1敲除显著性减少肿瘤的体积和重量(a-c),同时抑制了CBX4和VEGFA的表达(d-e)。肺转移模型中,circTLK1沉默显著减弱了肺部肿瘤转移(f-h)。同时,在肿瘤模型中过表达CBX4可以逆转circTLK1沉默诱导的RCC真人投注生长抑制(i)。证明circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA调控机制可能在促进体内RCC真人投注的生长和转移过程中有重要的作用。

7. circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA调控机制图

参考文献:
    Jianfa Li, Chenchen Huang, Yifan Zou et al. CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol Cancer. 2020; 19(103).


 


我是混淆代码

如果您的浏览器未跳转,请点击此处进行游戏并领取优惠

技术支持 AI智能站群 luis888.vip@gmail.com