CircRNA调控组蛋白修饰在真人投注中的研究
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-07-09
真人投注是最常见的恶性肿瘤之一,迫切需要更有效的生物标志物和靶标以进行更好的诊断和治疗真人投注...

    真人投注是最常见的恶性肿瘤之一,迫切需要更有效的生物标志物和靶标以进行更好的诊断和治疗真人投注。circRNA可作为癌症的潜在诊断生物标志物,并代表新的治疗目标。今日这篇文章和大家一起探索circRNA在真人投注中的功能和潜在机制。
技术路线:

结 果:
1.人真人投注组织中环状RNA (circMRPS35)的鉴定与验证
    RNA测序分析癌组织和邻近的正常组织中circRNA表达,13个circRNA在真人投注中明显下调,有9个上调。在30对真人投注和邻近正常组织中验证表达,发现源自MRPS35基因的circ_0000384差异最显著。发散和聚合引物PCR扩增以及Sanger测序证实circRNA的环状结构,circMRPS35具有更高的RNA酶抵抗力,转录抑制剂Dactinomycin D
处理后circMRPS35比MRPS35 mRNA稳定。以上表明,circMRPS35是在真人投注组织中低表达的稳定circRNA。

2.CircMRPS35表达与真人投注的良好预后相关
    circMRPS35在真人投注组织的表达显著减少,circMRPS35的表达水平与晚期肿瘤结转移(TNM)分期、淋巴转移和肿瘤大小呈负相关,ROC曲线分析表明circMRPS35可用于预测患者的预后。

3.体外CircMRPS35抑制真人投注细胞的增殖和转移
    为评估circMRPS35的功能,分析circMRPS35在各种人类真人投注细胞系和GES-1细胞的表达。发现circMRPS35水平在SGC7901和MKN28细胞中较低。质粒pCDH-CMVCircMRPS35转染后,明显增加,在SGC7901和MKN28细胞中过表达CircMRPS35,抑制细胞生长并诱导细胞周期停滞在G1期,抑制细胞侵袭。siRNA抑制circMRPS35表达,明显促进细胞增殖、细胞周期加速和侵袭。这些结果验证circMRPS35可以调节体外培养真人投注细胞的行为。

4.体内CircMRPS35抑制癌细胞的生长和转移
    在体内,circMRPS35降低异种移植小鼠模型中的肿瘤生长和重量,circMRPS35过表达的肿瘤中Ki-67和PCNA降低,裸鼠肺中的转移灶降低。shRNA慢病毒抑制CircMRPS35则增加了肿瘤的生长、肿瘤的重量以及Ki-67和PCNA的表达,增加裸鼠肺部转移灶的数量。

5.CircMRPS35通过FOXO1和FOXO3a的转录激活抑制真人投注进展
    circMRPS35敲低后进行RNA序列,GO和KEGG分析表明FOXO信号是circMRPS35参与癌症调节最相关的信号。FOXO家族是进化保守的,包括FOXO1,FOXO3a,FOXO4和FOXO6四个成员。circMRPS35增加FOXO1和FOXO3a的mRNA和蛋白质水平,CircMRPS35敲低对FOXO1和FOXO3a的磷酸化没有影响。circMRPS35改变FOXO1和FOXO3a的靶基因(p21,p27,Twist1,E-cadherin)的表达,FOXO1的减少显著减弱circMRPS35的促进p21和p27表达,挽救细胞周期停滞并抑制细胞增殖。荧光原位杂交表明circMRPS35主要位于细胞核内,circMRPS35增强FOXO1和FOXO3a的启动子活性。总而言之,circMRPS35通过转录激活FOXO1和FOXO3a抑制真人投注细胞的行为。

6.CircMRPS35的表达与真人投注组织中的FOXO3a和FOXO1对应
    真人投注组织中FOXO1或FOXO3a表达均显著下降,FOXO1的表达与呈肿瘤大小负相关,FOXO3a表达与晚期TNM阶段、淋巴结转移呈负相关。ROC曲线表明FOXO1和FOXO3a表达可用于预测患者的预后。FOXO1或FOXO3a的低表达与真人投注患者的不良生存密切相关,FOXO1和FOXO3a表达与circMRPS35呈正相关。这些表明circMRPS35介导的FOXO1和FOXO3a信号在真人投注中起关键作用。

7.CircMRPS35招募KAT7到FOXO1和FOXO3a基因的启动子
    进一步研究circMRPS35激活FOXO1和FOXO3a转录的机制,细胞裂解物与生物素化circMRPS35探针孵育,RNA下拉测定和质谱分析参与转录调控的蛋白质KAT7。在MGC803细胞核中circMRPS35 与KAT7共定位,circMRPS35片段形成多个氢键与KAT7残基相互作用,KAT7(256-315aa)C2H2域对与circMRPS35的相互作用至关重要。FOXO1和FOXO3a启动子区域中H4K5ac,H4K12ac和H3K14ac的表达富集,ChIP证明只有H4K5ac结合到FOXO3a和FOXO1的启动子区域,RNA下拉和RIP证明H4K5ac与circMRPS35特异性相互作用,circMRPS35与KAT7和H4K5ac表明circMRPS35与H4K5ac和KAT7相互作用形成三聚体。在circMRPS35 /KAT7/H4K5ac的复合物中,H4K5ac残基77-84停靠KAT7形成的口袋中,H4K5ac具有α-螺旋基序的残基54–77与KAT7的563-576位残基相互作用,circMRPS35直接与FOXO1和FOXO3a启动子区域结合。以上表明circMRPS35将KAT7募集到FOXO1和FOXO3a的启动子。KAT7的敲低减弱circMRPS35增加的FOXO1和FOXO3a基因启动子处H4K5ac水平,敲低KAT7大大降低circMRPS35诱导的FOXO1和FOXO3amRNA和蛋白质表达。以上表明,circMRPS35通过招募KAT7增加了FOXO1和FOXO3a启动子区域中的H4K5的乙酰化水平。

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