基金又一新方向———真人投注网站焦亡的抑制
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-06-23
真人投注网站焦亡(pyroptosis)是一种新发现的真人投注网站程序性死亡方式,表现为真人投注网站不断胀大直至真人投注网站膜破裂...

    真人投注网站焦亡(pyroptosis)是一种新发现的真人投注网站程序性死亡方式,表现为真人投注网站不断胀大直至真人投注网站膜破裂,导致真人投注网站内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。真人投注网站焦亡是机体重要天然免疫反应,在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用。相比于真人投注网站凋亡(apoptosis),真人投注网站焦亡发生的更快,并会伴随大量促炎症因子的释放。2020年 03 月20日,  Muendlein HI,   Jetton D,   Connolly WM,  等人,在Science上发表了一篇关于cFLIP抑制真人投注网站焦亡的机制文章“cFLIP protects macrophages from LPS-induced pyroptosis via inhibition of complex II formation”。

    真人投注网站死亡和炎症是宿主对感染的相互依赖的反应。 在焦真人投注网站凋亡期间,白真人投注网站介素1b(IL-1b)的释放通过caspase-1和caspase-11介导的Gasdermin D孔形成。 在体内,对脂多糖(LPS)的反应导致IL-1b分泌。 然而,在体外,鼠巨噬真人投注网站需要炎性体驱动的IL-1b成熟的第二个“危险信号”。 最近的报道显示,在LPS活化的巨噬真人投注网站中caspase-8介导的真人投注网站凋亡,但在这些条件下有关IL-1b释放的证据相互矛盾。 在这里,为了进一步表征LPS诱导的体外分泌机制,作者揭示了真人投注网站FLICE样抑制蛋白(cFLIP)在调节炎症反应中的重要作用。
1.TAK1抑制之前的LPS启动
    LPS驱动的死亡需要CASP8和GSDMD,但不需要NLRP3,CASP1或CASP11。 这表明cFLIP L缺乏症在LPS激活后严格促进焦磷酸化。 cFLIP L KD消除了抑制TAK1诱导发烧的要求。 cFLIP L的沉默概括了TAK1抑制作用(通过YopJ或5z7处理),暗示cFLIP L是响应LPS的主要真人投注网站凋亡调节因子之一。

                                     图1. TAK1抑制之前的LPS启动引发IL-1b释放,抑制真人投注网站死亡并调节cFLIP水平。
    (A)BMDM中B6,无RIP1激酶失活(RIP1Ki),Trif-/-,Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-的小鼠在LPS / 5z7处理下的真人投注网站死亡。 (B)在指定治疗后6小时,IL-1b从B6 BMDM中释放。 LPS预灌注(10或100 ng / ml)分别在添加5z7或尼日灵之前4小时进行。 (C)与LPS / 5z7或LPS-pre-primed / 5z7同时刺激的B6 BMDM中的真人投注网站死亡。 (D)在B6 BMDM中,LPS,LPS / 5z7或LPS预涂底漆/ 5z7处理1小时后,相对于Cflar mRNA水平标准化为Gapdh(磷酸甘油醛磷酸脱氢酶)。 R.U.,相对单位。 (E)cFLIP,GSMDD的全长(FL)和裂解产物,以及从LPS / 5z7或LPS–预处理的B6 BMDM的全真人投注网站裂解液(WCL)或从上清液(Sup。)沉淀的胱天蛋白酶。 (F)B6 BMDM中的cFLIP蛋白水平被cFLIP L或cFLIP R击倒或用非靶向(NT)对照转导。(G)B6 BMDM中被cFLIP L或cFLIP R击倒并被刺激的真人投注网站死亡[在(F)中显示的敲低程度]。来自真人投注网站死亡测定和免疫印迹的数据代表了三个或更多独立实验,并且真人投注网站死亡数据表示为一式三份孔的平均值±SD。 IL-1b释放数据表示为来自三个或更多独立实验的一式三份孔的平均值±SD。使用方差分析(ANOVA)用于组间比较。
2.cFLIP L是响应LPS的真人投注网站凋亡的主要调节剂之一
    真人投注网站死亡需要受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIP1)和GSMDD的激酶活性,但伴随着低的IL-1b水平,这可能是由于抑制了MAPK和NF-kB介导的前IL- 1b生产。与同时用LPS和5z7处理的真人投注网站相比,在5z7处理之前用LPS预灌注的骨髓衍生巨噬真人投注网站(BMDM)产生的IL-1b水平明显更高。

                                        图2. LPS在不存在cFLIP L的情况下诱导caspase-8介导的真人投注网站凋亡。
    (A)B6,Trif-/-和RIP1Ki BMDM中的真人投注网站死亡被cFLIP L击倒并受到刺激。 (B)用LPS或LPS / 5z7刺激长达1小时30分钟的B6和B6 cFLIP L -KD BMDM中PI掺入和膜联蛋白V染色的动力学20倍放大成像。比例尺:100 mm。 (C)从半纤维素裂解物(WCL)或从B6NT对照或B6cFLIP L -/-BMDMs的上清液中沉淀的所示半胱氨酸蛋白酶的全长和裂解产物。 (D)在LPS / 5z7刺激的B6巨噬真人投注网站或LPS处理的cFLIP L -KD BMDM中用CASP3 / 7抑制剂抑制真人投注网站死亡。 (E)用LPS或LPS / 5z7刺激的B6,Nlrp3-/-和Casp1-/-Casp11-/-巨噬真人投注网站中的真人投注网站死亡。 (F)B6,Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-BMDM中的真人投注网站死亡被击倒并被刺激(如图S3I所示的KD),刺激了cFLIPL。 (G)从B6NT控制器B6cFLIP L -KDBMDM刺激的全长和切割GSDMD所示。 在WT或YopJ缺陷型(DyopJ)Y。假性结核病刺激下的B6NT和B6cFLIP L -KD BMDM中,CASP8和GSDMD的真人投注网站死亡和(I)裂解(图S3L所示的KD的程度)。未感染,未感染。所有的免疫印迹和真人投注网站死亡数据代表三个或更多独立实验。真人投注网站死亡数据表示为一式三份孔的平均值±SD。
3.cFLIP L缺失促进LPS响应
    cFLIP L不足足以驱动对LPS的复合物II的形成。 LPS / 5z7也推动了复合物II的形成,并且在早期时间点在复合物中检测到了cFLIPL。 LFL诱导的cFLIP L -KD真人投注网站中复合物II的形成依赖于TRIF和RIP1激酶活性。 在cFLIP L -KD真人投注网站中,复杂II的形成和LPS诱导的真人投注网站死亡都需要进行修饰。 因此,cFLIP L和RIP1的激酶活性调节TRIF信号下游的复合物II的形成,并决定真人投注网站死亡的程度和方式。

                                         图3. cFLIP L缺乏促进LPS响应,在TRIF下游形成复合物II。
    (A)B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或用NT对照转导。 (B)按指示刺激的B6 NT和B6 cFLIP L -KD BMDM中的FADD免疫沉淀(IP),并探测复合物II成分。(A)中显示的敲低程度(C)B6和Trif-/-BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或NT对照转导。(D)B6和Trif-/-BMDM中的FADD IP被敲除cFLIP L,如所示被刺激,并探测复杂的II成分[(C)所示的敲低程度]。 (E)B6和RIP1Ki BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或用NT对照转导。 (F)B6和Trif-/-BMDM中的FADD IP击倒cFLIP L,如所示进行刺激,并检测复杂的II成分[(E)中所示的敲低程度]。 (G)B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平降低了cFLIP L或用NT控件进行转导。 (H)如所示刺激2小时的B6 NT和B6 cFLIP L -KD中的FADD IP,并检测复合物II成分[(G)中显示的敲低程度)。 (I)B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L击倒或用NT对照转导。 (J)LPS和LPS / 5z7刺激的cFLIP L沉默或NT对照B6和RIP1Ki BMDM中的总和pRIP1(S166)水平[(I)中显示的敲低程度]。所有的免疫印迹代表三个或更多独立实验。
4.cFLIP L缺失,LPS激活的巨噬真人投注网站迅速分泌IL-1b
    当cFLIP L水平低时,CASP8同型二聚体容易形成。完全活跃的CASP8裂解并激活远处的靶标,LPS激活的巨噬真人投注网站迅速经历热解并分泌IL-1b。在不存在cFLIP L的情况下,CASP3,CASP7和CASP9对于CASP8驱动的真人投注网站凋亡是必不可少的。相反,CASP8可能直接激活GSDMD来驱动真人投注网站凋亡,而NLRP3炎症小体来驱动IL-1b成熟和释放。

                                       图4. cFLIP L缺乏会驱动IL-1b成熟并响应来自LPS的单个信号而释放。
    (A到C)IL-1b从(A)B6 NT对照,B6 cFLIP L -/-和B6 cFLIP R -/-BMDM释放; (B)为cFLIP L敲低的RIP1Ki和Trif-/-BMDM; (C)经过指定治疗6小时后,RIP3 / CASP8和GSDMD缺陷型BMDM敲低cFLIP L。(D)用LPS刺激4小时,或用LPS尼日利亚霉素刺激2小时的B6 NT对照和B6 cFLIP L-/- BMDM中的ASC斑点的代表性60X图像(图S4D中显示的敲低程度)。比例尺:30毫米。在针对cFLIP L的B6,Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-BMDM中ASC +真人投注网站的百分比。 (F) IL-1b在b6,Nlrp3-/-和Casp1-/-Casp11-/-巨噬真人投注网站中释放,对于cFLIP L沉默并如所指示的被刺激。(G)B6 BMDM对cFLIP L沉默并用WT或缺乏YopJ的(DyopJ)假结核耶尔森氏菌6小时。 (H)由cFLIP L调节的LPS驱动的真人投注网站凋亡和IL-1b产生的模型。 IL-1b释放和ASC百分比数据表示为来自三个或更多独立实验的一式三份孔的平均值±SD。方差分析(ANOVA)用于比较各组。
结 论:
    长异构体cFLIP L的缺乏会促进复合体II的形成,从而引起焦磷酸化,并且它们仅响应LPS就能分泌IL-1b。



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