2型糖尿病的治疗新方法—SPION-真人投注网站载药
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-29
BAY55-9837是一种潜在的治疗2型糖尿病(T2DM)的多肽,能够诱导葡萄糖(GLC)依赖性胰岛素分泌......

   BAY55-9837是一种潜在的治疗2型糖尿病(T2DM)的多肽,能够诱导葡萄糖(GLC)依赖性胰岛素分泌。但BAY55-9837的半衰期短、靶向性差、血GLC反应差,限制了其治疗效果。如何提高BAY55-9837的血液GLC反应是一个亟待解决的问题。近期一篇发表在杂志Small上的文章“SPION-Decorated Exosome Delivered BAY55-9837 Targeting the Pancreas through Magnetism to Improve the Blood GLC Response” 报道了利用工程化的真人投注网站载药靶向胰腺治疗2型糖尿病的研究。

   在本研究中,我们展示了一种制备载有BAY55-9837的真人投注网站的方法,该真人投注网站与超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)相结合,具有胰岛靶向活性,并在磁力(MF)的帮助下增强血液GLC反应。载有BAY55-9837的SPION修饰的真人投注网站的等离子半衰期是无SPION修饰的真人投注网站的27倍。SIPONs的主动靶向性使真人投注网站获得良好的靶向性,提高BAY55-9837的血液GLC反应能力。体内研究表明,载BAY的真人投注网站载药能够增强胰岛靶向性,显著增加胰岛素分泌,从而减轻高血糖。慢性给予载BAY的真人投注网站可显著改善糖化血红蛋白和脂质。载BAY的真人投注网站可能是一种很有前途的T2DM肽药物载体,具有更好的血液GLC反应。
结果:

1.BAY-Exosome-SPION的特征
   载有BAY55-9837的SPION修饰的真人投注网站的构建和纯化步骤如图1A所示。添加羧化壳聚糖(CS)来制备受尺寸控制的SPION。实验中所用CS修饰的SPION(CS-SPION)的尺寸分布如图1B所示。在+2.5 mV处测量离子的zeta电位,羧化CS修饰后电位降至0.28.6 mV(图1C),这可能与CS的羧基带负电荷有关。接下来,构建Tf-SPION并进行磁分离纯化。图1D为Tf、CS-SPION、Tf- SPION的FT-IR分析结果。结果表明结合过程中化学键发生了变化。在此基础上,研究了Tf-SPION的稳定性。图1E显示Tf-SPION的大小在形成后的最初几天内保持稳定。然而,Tf- SPION在形成后第37天显著增大。Tf-SPION的高稳定性为今后BAY55-9837的SPION修饰的真人投注网站的合成提供了支持。在合成和纯化后,通过以下实验对真人投注网站进行评价。Western blot分析结果显示,磁性分离获得的真人投注网站表达了特征性的真人投注网站膜蛋白CD9、CD63以及TfR,证实了真人投注网站与Tf-SPION的成功结合(图1F)。透射电镜显示,真人投注网站呈圆形形态,分布良好,平均直径约100 nm(图1G),符合文献报道的真人投注网站特征。



2.BAY-Exosome-SPION释放谱、药代动力学参数和靶向能力
   药物释放行为在生物分布、药代动力学、毒性、药物渗漏等方面起重要作用,缓释一般表现出较好的治疗活性。图2A显示了BAY55-9837从真人投注网站释放到培养基中的情况。前5 h真人投注网站释放BAY55-9837较明显,随后持续缓慢释放,60 h后累积释放量达62.0%,说明真人投注网站较好地保护了BAY55-9837的降解。图2B为BAY55-9837、BAY-exosome和BAY-exosome-SPION的血清清除曲线。BAY55- 9837表现出较短的寿命;然而,当负载真人投注网站或真人投注网站-SPION时,BAY55-9837可检测约120小时。治疗药物的靶向性是药物治疗的关键。图2C中的示意图显示,在MF的帮助下,螺旋修饰的真人投注网站倾向于在细胞表面积聚。图2D的结果证实了在MF存在的情况下,标记了红色染料的真人投注网站被吸引到MIN-6细胞表面,增强了BAY55-9837与其受体的细胞结合。



3.BAY-Exosome-SPION 对β-Cell的影响
   2型糖尿病的特点是外周胰岛素抵抗和胰岛β-细胞功能障碍,因此,BAY55-9837,exosome,BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION/MF的胰岛素促分泌素的影响被调查。在没有GLC的情况下,BAY55-9837,exosome,BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION/MF不能诱导胰岛素分泌。而在存在GLC的情况下,BAY55-9837,exosome,BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION/MF较对照组胰岛素分泌明显增加,符合BAY55-9837诱导胰岛素分泌的GLC依赖性(图3A,3C,3D)。与BAY55-9837或BAY-exosome-SPION相比,BAY-exosome-SPION/MF的引入使胰岛素分泌增加最大,验证了MF和exosome-SPION的应用显著增强了BAY55-9837对其受体的结合效能。然而,无论是否存在GLC,真人投注网站都不能诱导MIN-6细胞分泌胰岛素(图3B)。高GLC或脂肪酸水平诱导的活性氧是胰岛β细胞功能障碍的主要原因。因此,将MIN-6细胞与棕榈酸一起培养24小时,以建立氧化损伤模型。如图3E所示,在0.8 mmol L-1棕榈酸存在下,100 nmol L-1 BAY55-9837接近峰值浓度,激活了MIN-6细胞的胰岛素分泌;因此,与100 nmol L-1浓度相比,1000 nmol L.1 BAY55- 9837不能显著增加MIN-6细胞的胰岛素分泌。当BAY55-9837浓度低于100 nmol L-1时,增加BAY55-9837浓度可显著提高胰岛素分泌。因此,在BAY55- 9837、BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION /MF浓度高于100 nmol L-1时,MIN-6细胞的胰岛素分泌无明显差异(图3E,3G,3H)。此外,在0.8 mmol L-1棕榈酸和GLC存在的情况下,真人投注网站不能诱导MIN-6细胞产生胰岛素(图3F)。



4.BAY-Exosome-SPION对GLC诱导的胰岛素分泌信号通路的影响
   图4A总结了VPAC2介导胰岛素分泌的可能途径。AC/cAMP/PKA/Ca2+和AC/cAMP/Epac2/Ca2+信号通路是参与VPAC2介导的胰岛素分泌的两个主要信号通路。图4B、C显示,BAY-exosome-SPION/MF随时间增加cAMP含量,增强PKA活性,这表明BAY-exosome-SPION/MF在VPAC2介导的通路中诱导胰岛素分泌。最近的一项研究表明,Cav1.2的serine 1928 (Ser1928)磷酸化对调节蛋白激酶A (PKA)介导的l型Ca2+通道至关重要。如图4D所示,BAY-exosome-SPION/MF可诱导Cav1.2的Ser1928磷酸化,且随时间变化,这与PKA活性的变化一致。随后,利用Ca2+指标fluo-3 AM监测MIN-6细胞内Ca2+水平。如图4E所示,Ca2+内流在BAY-exosome- SPION/MF刺激下发生。为了进一步阐明PKA和l型钙通道在BAY-exosome-SPION诱导的胰岛素分泌中的作用,我们使用了PKA (KT5720)和l型钙通道(NaHS)抑制剂。如图4F所示,NaHS和KT5720的应用明显抑制了BAY-exosome-SPION/MF诱导的胰岛素的分泌。此外,在无Ca2+的培养基中,BAY-exosome-SPION不能诱导胰岛素分泌。因此,我们可以得出结论,在MIN-6细胞中,BAY-exosome-SPION/MF通过cAMP/PKA/Ltype Ca2+信号通路促进胰岛素分泌,这与VPAC2介导的胰岛素分泌信号通路是一致的。



5.BAY-Exosome-SPION在体内的分布
   为了确定BAY-exosome-SPION/MF的靶向能力,我们利用非侵入性近红外荧光技术(NIRF)研究了Cy5.5标记的BAY55-9837或BAY-exosome-SPION在小鼠体内的生物分布。如图5A、C所示,经静脉注射1h后,在肝脏周围检测到微弱的荧光信号,经BAY55-9837处理8 h后,信号开始下降,几乎完全消失。同时,在没有MF的情况下,经BAY-exosome-SPION处理的小鼠肝脏周围8小时内可观察到微弱的荧光信号。在MF (1h)的帮助下,在静脉注射BAY-exosome-SPION后1h和8h,在胰岛和肝脏周围均观察到强烈的荧光信号,说明BAY-exosome- SPION具有明显的磁靶向性。此后,小鼠被euthanasia,并收集相关器官用于NIRF。如图5B所示,BAY55-9837处理小鼠各器官均未检测到荧光信号。而经BAY-exosome-SPION处理的小鼠各主要器官中检测到微弱的荧光信号,验证了基于真人投注网站的纳米给药系统作为药物载体具有保护作用和BAY55-9837的缓释能力。在BAY-exosome-SPION/MF组中,胰岛检测到强荧光信号。此外,对主要器官荧光强度的定量进行了评价。如图5D所示,与BAY-exosome-SPION组相比,MF的应用使胰岛的荧光强度增加了约11.5倍。


6.BAY-Exosome-SPION对2型糖尿病小鼠的治疗作用
   
为了研究BAY-exosome-SPION / MF对GLC耐受性和胰岛素分泌的急性作用,用BAY55-9837,BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION / MF处理了db / db糖尿病小鼠,然后动态测量血液GLC和胰岛素水平(图6A)。如预期的那样,模型小鼠显示出GLC耐受性受损,同时GLC刺激的胰岛素分泌显着减少。与BAY55-9837相比,观察到BAY-exosome-SPION的GLC降低作用,并一直持续到120分钟。在存在MF的情况下使用BAY-exosome-SPION处理比使用BAY-exosome-SPION的单一处理更有效地降低了血浆GLC,这证实了MF的应用显著增加了BAY-exosome-SPION的局部浓度,因此证明了更好的血液GLC响应效果(图6B)。血浆胰岛素水平的改善与血浆GLC水平的变化相符,BAY-exosome-SPION / MF具有最佳的促进胰岛素分泌的能力,紧随其后的是BAY-exosome-SPION组,最低的是BAY55-9837组(图6C)。此外,由于真人投注网站延长了BAY55-9837的血浆半衰期,因此在8小时后再次进行了腹膜内GLC耐受性测试(IPGTT),以研究BAY-exosome-SPION/MF对GLC耐受性和胰岛素的影响。 图6D和图6E证明仅在BAY-exosome-SPION/MF组中检测到显著的GLC降低作用和促胰岛素能力。 与第一个IPGTT相比,BAY-exosome-SPION在降低血浆GLC水平和促进胰岛素分泌方面显示出较弱的能力,而BAY-exosome-SPION/MF在降低血浆GLC水平和促进胰岛素分泌方面具有相当的能力,表明在exosome-SPION 和MF的帮助下,BAY55-9837具有出色的GLC响应能力。为了评估BAY-exosome-SPION/MF对T2DM的慢性代谢作用,用BAY55-9837,BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION / MF处理了模型小鼠。如图6F,I所示,每天使用BAY-exosome-SPION/MF处理模型小鼠,其糖化血红蛋白和体重均显著降低。肝脏在控制碳水化合物代谢和脂质稳态方面具有重要作用,T2DM患者可观察到肝脏脂质代谢功能障碍。我们的结果显示,经BAY-exosome-SPION/MF处理后,血TG和肝TG均下降(图6G,H),表明模型小鼠的肝功能明显改善。

结论:
   在本研究中,我们展示了一种制备载有BAY55-9837的SPION修饰的真人投注网站的方法。BAY-exosomes经电穿孔加载BAY55-9837获得成功。通过Tf-TfR相互作用将Tf-SPION偶联到BAY-exosome上,产生BAY-exosome-SPION,从而赋予BAY-exosomes超顺磁性。真人投注网站的保护作用使BAY55-9837具有更长的等离子半衰期,而SIPONs的主动靶向性使BAY-exosomes获得良好的靶向性。因此,在MF的帮助下,BAY-exosome-SPION能对GLC的升高做出适当的反应,从而在胰岛中积累,促进胰岛素的分泌。因此,BAY-exosome-SPION/MF被证明是改善T2DM患者血液GLC反应的一种有前途的方法。

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