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栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-27
Hippo信号通路在发育和癌症进展中起着关键作用。然而,本质上抑制这种途径的分子还不太为人所知......

   Hippo信号通路在发育和癌症进展中起着关键作用。然而,本质上抑制这种途径的分子还不太为人所知。“Kindlin-2 Inhibits the Hippo Signaling Pathway by Promoting Degradation of MOB1”一文研究报道了黏着斑分子Kindlin-2通过与MOB1相互作用并降解MOB1和促进MOB 1与E3连接酶praja2之间的相互作用来抑制希波信号传导。Kindlin-2因此抑制LATS1和YAP的磷酸化,并促进YAP转位入核,在核中激活下游Hippo靶基因转录。Kindlin-2缺失激活Hippo/YAP信号并减轻真人投注输尿管梗阻的Kindlin-2敲除小鼠的肾纤维化(真人投注输尿管阻塞)。而且,肾纤维化患者样本中Kindlin-2水平与MOB1和磷酸化YAP呈负相关。

文章亮点:

1.Kindlin-2通过其E3连接酶praja2介导MOB1蛋白酶体降解
2.Kindlin-2通过促进MOB1的降解抑制YAP的磷酸化
3.Kindlin-2耗竭激活Hippo途径,减轻真人投注输尿管阻塞诱导的肾纤维化
4.长效Kindlin-2 siRNA对真人投注输尿管阻塞诱导的肾纤维化具有治疗价值

图形摘要:

结果:

一、Kindlin-2与MOB1相互作用并抑制Hippo信号通路的激活
   Kindlin-2在质谱分析中被鉴定为与MOB相互作用,表明Kindlin-2参与了Hippo信号通路。此外,内源性MOB1在HEK293T细胞中与Kindlin-2和FLAG-Kindlin-2共免疫沉淀(图1A和1B)。相反,内源性Kindlin-2在HEK293T细胞中被MOB1共免疫沉淀(图1C)。这些结果表明Kindlin-2和MOB1在活细胞中相互作用。谷胱甘肽转移酶(GST)下拉结果显示MOB1与Kindlin-2的氮端和中间区都有很强的相互作用,而与碳端的相互作用很弱。免疫荧光染色显示Kindlin-2和MOB1共定位于HK2细胞的细胞质(图1d)。上述数据表明Kindlin-2直接与MOB1相互作用。接下来确定Kindlin-2和Hippo信号通路之间是否存在调节关系(图1e和1F)。Kindlin-2过表达导致MOB1、pMOB-35、pLATS1-909和pYAP-127水平下降。然而,对经前S1、经前T1、经后T1、经前S1或经后叶无明显影响。Kindlin-2表达的减少导致MOB1、pMOB-35、pLATS1-909和pYAP-127水平的增加,这表明希波信号的激活,但是没有观察到对pMST1、MST1、LATS1或YAP的明显影响(图1E和1F)。此外,Kindlin-2过表达导致HKC和HEK293A细胞核中YAP水平升高,而Kindlin-2表达降低导致细胞核中YAP水平降低, 核中的YAP水平是根据Kindlin-2功能的获得或丧失(图1G)。qPCR显示Kindlin-2过表达促进CTGF和CYR61mRNA表达。相反,Kindlin-2的表达减少受到抑制CTGF和CYR61mRNA表达(图1H)。因此,Kindlin-2抑制MOB1的表达和磷酸化。MOB1水平的降低会抑制LATS1的完全磷酸化;YAP的去磷酸化促进其向细胞核的转移,在细胞核中它促进下游靶CYR61和CTGF的转录。该机制在中建模图1. 虽然Kindlin-2不影响YAP的水平,但Kindlin-2可能通过不同的上游机制调节Hippo/YAP信号通路。

                                                      图1. Kindlin-2与MOB1相互作用并抑制Hippo(Hippo)通路的激活

二、Kindlin-2介导MOB1蛋白酶体降解
   Kindlin-2不影响MOB1HEK293T或HKC细胞中的转录(图2A和2B)。探讨Kindlin-2介导MOB1降解的机制发现,在HEK293T细胞中过表达的FLAG-Kindlin-2以剂量依赖性方式显著降低内源性MOB1的蛋白水平(图2C)。此外,Kindlin-2降低MOB1水平的作用通过用MG132蛋白酶体的抑制剂 (图2D),表明Kindlin-2对MOB1降解的影响是由蛋白酶体蛋白降解途径介导的。使用
Cycloheximide追踪试验测量了Kindlin-2存在或不存在时MOB1的周转率发现,与在HEK293T和HKC细胞中使用空载体相比,用Kindlin-2转染导致内源性MOB1的半衰期显著减少(图2E和2F)。与在HEK293T细胞中使用空载体时相比,用Kindlin-2小干扰核糖核酸 (siRNA) 转染导致内源性MOB1的半衰期显著增加(图2G和2H)。这些结果表明Kindlin-2通过蛋白酶体蛋白降解途径介导MOB1降解。机制模型图( 图 2I).

                                                                图2  Kindlin-2介导MOB1蛋白酶体降解

三、Kindlin-2通过增强MOB1与praja2的结合来介导MOB 1的降解
   Kindlin-2作为衔接蛋白不能直接降解MOB1。为了确定Kindlin-2是否通过praja2降解MOB1,发现praja2与FLAG-Kindlin-2共免疫沉淀(图3A)和HEK293T细胞中内源性Kindlin-2(图3B)。为了确定Kindlin-2和praja2之间结合所涉及的蛋白质区域,合成并表达了FLAG-praja-2的四个完整或截短版本:全长praja 2(aa 1–708)、aa 1–530区域、aa 531–708区域或aa 1–630区域(图3C),外源表达的GFP-Kindlin-2与全长FLAG-praja2(1–708)和aa 1–530区(图3D)。此外,双重免疫染色显示Kindlin-2和praja2共定位于HK2细胞的细胞质(图3E)。两步共免疫沉淀(coIP)分析,确定Kindlin-2、MOB1和praja2三种分子形成复合物(图3F)。Kindlin-2过表达增加了HEK293T细胞中MOB1与抗praja2抗体共免疫沉淀的量,而Kindlin-2缺失显示了相反的作用(图3G和3H)。Kindlin-2的过表达降低了pYAP、MOB1和pMOB1的水平,而Kindlin-2的过表达和praja2的同时缺失部分挽救了pYAP、MOB1和pMOB1的水平(图3I)。Kindlin-2通过praja2介导的肾细胞MOB1降解下调YAP磷酸化。这些结果表明Kindlin-2构成了praja2和MOB1之间的桥梁,增强了它们的相互作用,促进了MOB1的降解;模型图(图3J).

                                                                图3  Kindlin-2增强MOB1和praja2之间的相互作用

四、Kindlin-2缺失激活真人投注输尿管阻塞诱导Kindlin-2敲除小鼠肾纤维化中的Hippo信号
   由于Kindlin-2完全缺失的胚胎致死性,Kindlin-2敲除第一鼠标模型只能获得杂合子小鼠。基因型和Kindlin-2缺失效率被证实(图4A—4D)。Kindlin-2水平在真人投注输尿管阻塞之后显著增加。此外,在真人投注输尿管阻塞,Hippo信号通路与MST1、pMST1、pMOB1、LATS1、pLATS1、YAP和pYAP的上调和MOB1的下调一起被激活(图4E和4F)。然而,Kindlin-2敲除小鼠中Kindlin-2的缺失导致了Hippo信号通路的更多磷酸化和激活(伴随着pMOB1、pLATS1和pYAP的增加;p %3C 0.05),比在真人投注输尿管阻塞(图4E和4F)。免疫组织化学(IHC)和免疫荧光染色表明Kindlin-2的缺失激活了Hippo途径,但不影响真人投注输尿管阻塞(图4G)。此外,与野生型真人投注输尿管阻塞小鼠相比,Kindlin-2敲除真人投注输尿管阻塞小鼠显示肾纤维化标志物α-SMA、纤连蛋白和间充质标志物波形蛋白水平降低,但上皮标志物E-钙粘蛋白水平升高。与对侧相比,在野生型真人投注输尿管阻塞小鼠中occludin和claudin-3明显下调,而在Kindlin-2敲除真人投注输尿管阻塞小鼠中,这种明显的下调得到缓解。除了Hippo途径,Wnt途径在真人投注输尿管阻塞之后被激活;而Kindlin-2敲除真人投注输尿管阻塞小鼠与野生型真人投注输尿管阻塞小鼠相比,其TCF4和β-连环蛋白水平降低(图4E和4F)。Kindlin-2的过度表达导致了上皮钙粘蛋白水平的降低,但是纤维连接蛋白、胶原蛋白ⅰ和α-形状记忆合金(图4H,左侧)。相反,Kindlin-2表达的减少恢复了这些标记物的水平(图4H,对)。Kindlin-2 siRNA转染后,我们在HKC细胞中过表达YAP。这些结果表明YAP的过度表达逆转了由Kindlin-2缺失引起的ⅰ型胶原和α-SMA的减少(图4I),提示Kindlin-2通过Hippo/YAP途径促进肾纤维化。这部分在中建模图4J.

                                           图4  Kindlin-2缺失激活Kindlin-2基因敲除小鼠真人投注输尿管阻塞诱导的肾纤维化中的Hippo/YAP信号传导

五、长期siRNA诱导Kindlin-2耗竭抑制真人投注输尿管阻塞小鼠模型Hippo靶基因CTGF的上调
   在真人投注输尿管阻塞小鼠模型中设计了两个使用长效Kindlin-2 siRNAs的治疗实验。第一个实验,我们在真人投注输尿管阻塞后7天以上给野生型小鼠施用了5 nmol长效Kindlin-2 siRNA或对照siRNA(图5A).一般来说,晚期治疗组(第5组)和阴性对照组(第6组)的肾体积大于早期治疗组(第1-3组)。蛋白质印迹显示Kindlin-2被成功敲除,Kindlin-2的耗尽降低了CTGF和α-形状记忆合金水平(图5B和5C)。此外,形态学检测显示真人投注输尿管阻塞肾脏(组1-5)比对照组(组6;图5D),表明用长效Kindlin-2 siRNA治疗减轻了肾纤维化,早期治疗产生了更好的结果。在第二个实验中,证明了5 nmol长效Kindlin-2 siRNA或对照siRNA对真人投注输尿管阻塞后7天的野生型小鼠的作用(图5E)。蛋白质印迹显示Kindlin-2被成功耗尽,Kindlin-2的低水平导致CTGF、纤连蛋白和α-形状记忆合金的水平降低(图5F)。形态学检测显示Kindlin-2 siRNA组的真人投注输尿管阻塞肾纤维化症状比对照组siRNA较轻(图5G)。基于这些发现,提出了一个工作模型,其中给予长效Kindlin-2 siRNAs通过三种主要的信号通路(图5H)。

                                                  图5  长效Kindlin-2 siRNA对真人投注输尿管阻塞肾纤维化的治疗作用

六、人肾纤维化标本中Kindlin-2水平与MOB1和pYAP水平呈负相关
   与正常肾组织相比,肾纤维化组织中Kindlin-2、pYAP、YAP和CTGF水平较高,但MOB1水平较低(图6A和6C)。这些观察结果与真人投注输尿管阻塞模型中发现的结果一致(图4E)。此外,发现肾纤维化患者肾小管中Kindlin-2水平与MOB1和pYAP水平呈负相关,总YAP水平无显著变化(图6B和6D)。在Kindlin-2水平较高的肾小管细胞核中检测到的YAP水平高于Kindlin-2水平较低的细胞核(图6B和6D)。这些数据支持Kindlin-2与MOB1和pYAP负相关,并促进人肾纤维化中YAP的核转位。对正常肾和肾透明细胞癌TCGA数据的分析揭示了以下基因表达的正相关性FERMT2和YAP下游基因CTGF和CYR61(图6E–6H)。然而,在正常肾脏TCGA数据库分析中,FERMT2与YAP没有关联(图6I)。相反,通过分析肾透明细胞癌TCGA数据库,FERMT2被发现与YAP有关(图6J)。这些结果表明Kindlin-2在生理和病理条件下通过不同的分子机制调节Hippo/YAP信号通路。此外,Hippo/YAP的目标基因,CTGF和CYR61,与FERMT2正相关在正常肾组织和肾透明细胞癌组织中。无论何种条件,Kindlin-2都能促进YAP核转位,上调Hippo靶基因。

                                                    图6 Kindlin-2与人肾纤维化组织中Hippo/亚磷脂活化负相关
结论:
  表明Kindlin-2 通过MOB1的降解抑制Hippo信号传导。针对Kindlin-2 的特定长效siRNA有效缓解了真人投注输尿管阻塞诱导的肾纤维化,并可能成为肾纤维化的潜在疗法。


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