miR-541通过抑制自噬增强人肝癌对真人投注治疗的反应
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-22
自噬在HCC中也起着多方面的作用,包括促进肿瘤发生、维持肿瘤生长、促进转移以及对真人投注治疗的适应性反应......

   自噬在HCC中也起着多方面的作用,包括促进肿瘤发生、维持肿瘤生长、促进转移以及对真人投注治疗的适应性反应。miR-541的临床意义及其对自噬的影响尚未被探讨。在这里,小编与大家分享一篇近期发表与Gut上的文章“miR-541 potentiates the response of human hepatocellular carcinoma to sorafenib treatment by inhibiting autophagy”。在本项研究中,我们通过调节miR-541启动的miRNA-自噬轴,研究了肝癌细胞对真人投注致敏的可行性。


结果:

1.miR-541的下调与HCC患者生存期的缩短和复发的增加有关
   
我们首先通过在www. kmplot. com上搜索来研究miR-541在HCC患者中的预后价值。发现较低的miR-541水平与HCC患者较短的总生存期(OS)相关(图1A)。我们使用RT-PCR进一步验证了miR-541在HCC中的表达的临床意义。研究表明,与周围非肿瘤肝组织相比,肿瘤组织中miR-541的表达明显下降(图1B)。在大多数病例中观察到miR-541的下调(图1C)。临床病理分析表明,miR-541在人肝癌细胞中的下调与侵袭性临床病理特征显著相关。与www. kmplot. com上的结果一致,这些HCC样本中较低的miR-541水平也与HCC患者较短的OS相关(图1D)。此外,低miR-541表达组的复发率明显高于高miR-541表达组(图1 E)。关键的是,我们证实低水平的miR-541与较短的无复发生存期相关(图1F)。基于这些数据,miR-541的表达在临床上与癌症复发和患者预后相关。



2.miR-541在体内外抑制肝癌细胞的恶性特性
   我们通过转染miR-541模拟物或miR-541抑制剂的细胞,在体外评估了miR-541对人肝癌细胞系各种恶性特性的影响。过表达miR-541可显著抑制体外肝癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭(图2A-E)。相反,miR-541的抑制增加了HCC细胞的恶性表型。
   在HCC皮下植入肿瘤模型中,所有接受细胞感染Ad-Max的小鼠在接种后第4天即检测到移植瘤,而接受细胞感染Ad-miR-541的小鼠仅观察到一个结节。此外,Ad-miR- 541组的肿瘤生长和肿瘤重量显著降低(图2F-H)。另外,我们还通过向NOD/SCID小鼠体内注射被Ad-miR- 541或Ad-Max感染的荧光素酶标记的YY-8103细胞,研究了miR-541对体内HCC转移的影响。使用体外成像在Ad-Max组的9只小鼠中有5只在骨骼中检测到荧光素酶信号,但在Ad-miR-541组的10只小鼠中只有10只中有2只在骨骼中检测到(图2I,J)。同样,在Ad-Max组的9只老鼠中,3只老鼠的肺中检测到了荧光素酶信号,而在Ad-miR- 541组的10只老鼠中,只有1只老鼠的肺中检测到了荧光素酶信号。组织学分析证实Ad-miR- 541组的骨和肺中存在较小的肿瘤病灶(图2K)。这些数据表明,miR-541在HCC中具有强大的肿瘤抑制作用。



3.miR-541在体内外抑制肝癌细胞的自噬
   我们研究了miR-541对HCC细胞自噬的影响。研究表明miR-541过表达降低了HCC细胞中LC3 II的水平,提高了P62的水平(图3A)。相反,miR-541的抑制增加了LC3 II的水平,降低了P62在HCC细胞中的表达。免疫化学染色显示,与经Ad-Max处理的异种移植相比,经Ad-miR- 541处理的皮下异种移植中LC3阳性肿瘤细胞较少,P62阳性肿瘤细胞较多(图3 B,C)。TEM表明Ad-miR-541肝癌细胞的自噬小体数量减少(图3 D,E)。此外,使用mRFP-GFP-LC3报告基因构建的活细胞成像显示,自噬通量的速率被miR-541过表达显著抑制,被miR-541耗竭增强(图3F,G)。



4.ATG2A和RAB1B是miR-541的两个直接靶点
   我们进行了生物信息学分析,以识别可能参与自噬的miR-541候选mRNA靶点,并探讨miR-541抑制自噬的机制。分析显示miR-541与ATG2A和RAB1B之间的miRNA-target相互作用,它们是自噬的重要调控因子(图4A,B)。有趣的是,miR-541异位表达后,肝癌细胞中ATG2A和RAB1B mRNA和蛋白水平下降,miR-541抑制后则升高(图4 C,D)。通过miRNA预测程序,我们确定了ATG2A mRNA的3’UTR中miR-541的两个预测结合位点,以及RAB1B mRNA的3’UTR中miR-541的四个潜在结合位点(图4 A,B)。与我们的预测一致,miR-541的过表达降低了含有野生型ATG2A和RAB1B 3’UTR的构建体的荧光素酶活性,而3’UTR上所有靶序列的点突变均减弱了miR-541对荧光素酶活性的影响,这表明这两个基因代表miR-541的直接靶标(图4E,F)。此外,western blot和免疫组织化学染色检测到,miR-541水平的升高伴随着ATG2A和RAB1B蛋白表达的降低(图4 G,H)。在HCC样本中,ATG2A和RAB1B水平与miR-541水平呈负相关(图4I,J)



5.ATG2A和RAB1B在HCC细胞中具有致癌作用并促进自噬
   迄今为止,ATG2A和RAB1B在HCC中的真实作用尚不清楚。为了研究miR-541发挥抗肿瘤作用的潜在分子机制,我们首先在www. kmplot. com中检测了这两个基因在HCC患者中的预后价值。生存曲线显示ATG2A和RAB1B mRNA的高表达与较差的预后之间存在关联,这与miR-541的临床意义相反(图5 A,B)。接下来,我们使用针对ATG2A和RAB1B的siRNAs来研究它们的影响。结果表明,siATG2A和siRAB1B抑制增殖、集落形成、迁移和侵袭(图5C-I)。此外,siATG2A和siRAB1B降低了LC3 II的水平,增加了P62在HCC细胞中的表达(图5 J)和阻止自噬小体合成(图5 K,L)。基于这些结果,我们认为ATG2A和RAB1B是HCC自噬的癌基因和阳性调节因子。



6.miR-541通过下调ATG2A和RAB1B来抑制HCC中自噬的进展
   通过共转染miR-541抑制剂和siATG2A或siRAB1B进行了一系列拯救试验,以进一步研究miR-541介导的HCC抑制的分子机制。 在转染siATA2A和siRAB1B的细胞中,miR-541抑制剂对增加HCC细胞增殖,迁移和侵袭的作用显著降低(图6A-F)。 siATG2A和siRAB1B逆转了miR-541抑制剂促进自噬的作用(图6G,H)。 总体而言,ATG2A和RAB1B的下调至少部分有助于miR-541对HCC细胞的功能作用。



7.miR-541增强真人投注诱导的肝癌细胞体内外死亡
   考虑到自噬在加重真人投注耐药中的关键作用,我们随后研究了miR-541对HCC细胞对真人投注敏感性的影响。我们初步探讨了miR-541表达对HCC患者对真人投注反应的显著影响。对miR-541低表达或高表达的患者进行Kaplan-Meier生存分析,结果显示miR-541高表达的HCC患者可从真人投注治疗中获益,而miR-541低表达的患者则不能获益(图7A)。此外转染了miR-541模拟物的HCC细胞对真人投注的敏感性高于对照组细胞,其表现为50%的抑制浓度(IC50)降低,而转染了miR-541抑制剂的细胞对真人投注的耐受性高于对照组细胞,其表现为IC50的升高(图7B-E)。最后,我们评估Ad-miR-541治疗是否会加强真人投注对HCC的影响。裸鼠皮下移植HCC细胞,接受Ad-Max或Ad-miR- 541的瘤内注射,以及真人投注或vehicle DMSO的腹腔注射。Ad-miR- 541和真人投注均抑制肿瘤的生长、体积和重量(图7 F-H)。值得注意的是,Ad-miR-541和真人投注的联合使用产生了协同效应,与对照组相比,最大程度地抑制了肿瘤的生长。免疫组织化学染色显示,与Ad-Max和DMSO处理的肿瘤相比,Ad-miR-541治疗或真人投注治疗的肿瘤中Ki-67阳性肿瘤细胞数量减少,而Ad-miR-541和 真人投注联合使用进一步降低了Ki-67水平(图7I)。 此外,与对照组相比,用Ad-miR-541或Ad-miR-541和真人投注的联合治疗可导致ATG2A和RAB1B的表达明显降低,而与对照组(Ad-Max +DMSO)相比,真人投注治疗可可显著提高ATG2A和RAB1B的表达。 总而言之,miR-541增强了真人投注对HCC生长的抑制作用,这至少部分归因于其对ATG2A和RAB1B表达的调节作用。

结论:
   本研究强调了miR-541在HCC中的生物学意义,阐明了一个以前未被认识的HCC进展的分子机制。这些发现为HCC的个体化治疗提供了三个新的治疗靶点和预后标志物。推进基于miR-541的术后检测和治疗干预的转译研究将使HCC患者受益。

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