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栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-17
越来越多的证据表明,单链环状RNA在包括HCC的发生发展中起关键作用。但是,尚不清楚circRNA在HCC转移中起何种作用......

   越来越多的证据表明,单链环状RNA(circRNA)在包括肝细胞癌(HCC)的发生发展中起关键作用。但是,尚不清楚circRNA在HCC转移中起何种作用。 在这项研究中,作者通过circRNA测序,确定了circASAP1,它与HCC患者根治性切除术后的肺转移有关。本文于2019年12月发表在Hepatology (IF:14.971)。
结果如下:
1、鉴定circASAP1参与了HCC转移和预后

   对15例有肺转移和无肺转移的组织进行circRNA-seq,获得其差异真人投注的circRNA聚类热图和火山图(图1A-B)。其中最显著上调的包括circASAP1,其来源如图1C。qRT-PCR检测结果显示,三个circRNA中,只有circASAP1在转移性肺癌细胞系中显著高真人投注,且高真人投注circASAP1患者的总体生存期更短,复发率更高。总之,结果提示circASAP1参与了HCC转移和预后。


2、CircASAP1促进HCC转移和进展
   如图2A-D所示,circASAP1过真人投注促进了HepG2和PLC/PRF/5细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。图2E和F显示,敲除circASAP1显著降低了小鼠的肝肿瘤和肺转移结节。以上说明circASAP1促进HCC转移和进展。


3、CircASAP1海绵吸附miR-326和miR-532-5p
   作者采用RNA免疫沉淀法检测circASAP1与AGO2的结合,结果显示AGO2抗体可显著富集circASAP1(图3A),说明circASAP1被纳入RNA诱导的沉默复合物中。使用circASAP1特异性探针进行circRNA下拉实验,qRT-PCR检测到18个miRNA的富集,其中miR-326和miR-532-5p的含量显著高于其它miRNA(图3B)。如图3C和D所示,circASAP1和miR-326,miR-532-5p之前确实存在结合,以及共定位。以上证实,circASAP1可通过海绵吸附miR-326和miR-532-5p。


4、 CircASAP1通过海绵miR-326和miR-532-5p促进HCC转移和进展
   作者实验发现,过真人投注miR-326或miR-532-5p可抑制HCCLM3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,干扰其真人投注则相反。此外,抑制miR-326或miR-532-5p真人投注可以减轻circASAP1敲除引起的HCCLM3细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力下降(图4B),相反地,过真人投注miR-326或miR-532-5p则可废止过真人投注circASAP1引起的生物学反应(图4A)。此外,小鼠体内模型实验具有相似的结果(图4C和4D),提示circASAP1通过海绵miR-326和miR-532-5p促进HCC转移和进展。


5、在HCC细胞中circASAP1通过海绵吸附miR-326和miR-532-5p提高CSF-1和MAPK1的真人投注
   HCCLM3细胞中过真人投注miR-326或miR-532-5p均可显著降低CSF-1和MAPK1的mRNA和蛋白水平(图5A-D)。荧光素酶结果显示,miR-326和miR-532-5p均可显著抑制野生型3 -UTRs的CSF-1和MAPK1的荧光素酶活性,但对突变型则无影响(图5E)。此外,在HCC样本中,miR-326和miR-532-5p水平与CSF-1和MAPK1 mRNA真人投注呈显著负相关(图5F)。综上所述,在HCC细胞中,CSF-1和MAPK1是miR-326和miR-532-5p的直接靶点。
   之后作者研究了circASAP1是否调控CSF-1和MAPK1的真人投注。qRT-PCR、western blot、ELISA结果显示,circASAP1过真人投注时,CSF-1、MAPK1真人投注升高,敲除circASAP1后,真人投注降低(图5G、5H、5I)。此外,miR-326和/或miR-532-5p的过真人投注显着逆转了circASAP1过真人投注诱导的CSF-1分泌和MAPK1真人投注增加;类似的,敲除miR-326和/或miR-532-5p则有相反的效果(图5J)。在肝癌组织中CSF-1和MAPK1的mRNA真人投注水平与circASAP1水平呈正相关(图5K)。以上结果表明,在HCC细胞中circASAP1通过海绵吸附miR-326和miR-532-5p来增强CSF-1和MAPK1的真人投注。


6、CircASAP1通过调控miR-326/miR-532-5p-MAPK1信号轴来促进HCC细胞的增殖和侵袭
   MAPK1又名ERK2,通过ERK1/2途径发挥其功能,是众所周知的肿瘤启动子在肝细胞癌中上调真人投注。作者发现ERK1/2抑制剂SCH772984在不影响总ERK1/2蛋白水平的情况下,以剂量依赖性的方式显著降低ERK1/2磷酸化水平(图6A)。此外,SCH772984能以剂量依赖的方式阻断circASAP1诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭(图6B和C)。这些结果表明,circASAP1通过调控MAPK1的真人投注,影响ERK1/2信号通路,促进HCC细胞的增殖和侵袭。
   另一方面,作者发现circASAP1通过调节miR326/miR-532-5p-CSF-1信号来介导肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的浸润(图6D和E)。circASAP1通过CM促进了巨噬细胞从PLC/PRF/5细胞的增殖和迁移,下调则效果相反(图6F和G)。小鼠模型试验显示下调miR326/miR-532-5缓解了因异种移植中circASAP1基因敲除诱导的TAM浸润;而过真人投注miR-326/miR-532-5p可消除circASAP1诱导的F4/80+ TAMs在PLC/PRF/5异种移植物中的浸润(图6H)。这些结果表明,circASAP1通过调控miR-326/miR-532-5p-CSF-1信号通路来促进TAM细胞的浸润。


7、CircASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs对HCC患者有预后价值
   为了确定circASAP1、CSF-1、MAPK1和CD68+ TAMs在HCC中的临床意义,作者使用380例HCC原发肿瘤组织的组织芯片检测了这些因子的真人投注。图7A是典型案例图。circASAP1水平高的HCC肿瘤CSF-1和MAPK1真人投注水平高,TAM浸润增多(图7B)。高circASAP1真人投注水平患者的1年、3年和5年生存率显著低于circASAP1低真人投注水平患者,类似的,circASAP1高真人投注水平患者预后差,复发率高(图7C)。总之,circASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs对HCC患者有预后价值。

   总之,本文所讲述的故事如图7D所示,CircASAP1在HCC中通常上调真人投注,circASAP1与miR-326/miR-532-5p结合,降低其丰度,进一步抑制其靶基因CSF-1、MAPK1的真人投注,其中MAPK1通过ERK1/2信号通路,促进HCC细胞的增殖和侵袭,CSF-1则促进TAM细胞的浸润。
参考文献:
   Hu Zhi-Qiang., Zhou Shao-Lai., Li Jia., Zhou Zheng-Jun., Wang Peng-Cheng., Xin Hao-Yang., Mao Li., Luo Chu-Bin., Yu Song-Yang., Huang Xiao-Wu., Cao Ya., Jia Fan., Zhou Jian., (2019). Circular RNA Sequencing Identifies CircASAP1 as a Key Regulator in Hepatocellular Carcinoma Metastasis., Hepatology, undefined, undefined.

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