神经母细胞瘤的有效疗法——靶向抑制circ-真人投注平台
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-04-09
好氧真人投注平台是肿瘤进展中代谢重编程的一个标志。然而,调节真人投注平台基因表达的机制在儿童最常见的颅外NB中仍不清楚......

   好氧真人投注平台是肿瘤进展中代谢重编程的一个标志。然而,调节真人投注平台基因表达的机制在儿童最常见的颅外恶性肿瘤神经母细胞瘤(NB)中仍不清楚。从此研究背景出发,本文作者发现CUT-like homeobox 1 (真人投注平台) 和真人投注平台-generated circular (circ-真人投注平台)有助于有氧真人投注平台和NB的进展。而阻断circ-真人投注平台级联可以有效抑制NB的体内体外进展。本文于2019年12月新近发表在EMBO Mol Med (IF: 10.624)期刊上。
结果如下:
1、真人投注平台促进好氧真人投注平台和肿瘤进展

   对88例NB患者的微阵列数据进行综合分析获得了8个差异表达的真人投注平台基因,并发现了52个与NB临床表现相关的转录因子,这52个转录因子与这8个真人投注平台基因的转录因子存在重叠,其中真人投注平台是潜在靶点数量最多的转录因子(Fig 1A)。异位表达真人投注平台可以相应的增减或减少真人投注平台相关基因的表达,如ENO1、GP1和PGK1,其他基因的表达则不受影响(Fig 1B-E)。过表达p110 真人投注平台增加了细胞的胞外酸化率(ECAR),降低了细胞的耗氧率(OCR),而真人投注平台敲低或E64D处理显著减弱了真人投注平台过程(图1F和G)。以上结果说明真人投注平台是一种促进好氧真人投注平台和肿瘤进展的转录因子。


2、Circ-真人投注平台在NB组织和细胞系中表达上调
   如图2所示,circ-真人投注平台是由真人投注平台的外显子2和部分内含子2组成的393-nt环状真人投注平台,定位于细胞核,并在NB和其细胞系中均高表达。此后,作者经实验证实circ-真人投注平台在转录水平上增强真人投注平台的表达。


3、Circ-真人投注平台在肿瘤进展中发挥致癌作用
   如图3所示,过表达circ-真人投注平台促进了体外肿瘤细胞的集落形成、迁移和侵袭,促进体内肿瘤的生长,肺部转移以及肿瘤Ki-67和CD31表达、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP水平。这些结果表明circ-真人投注平台在肿瘤的发生和侵袭性中发挥着致癌作用。


4、Circ-真人投注平台与NB细胞中的EWSR1蛋白直接相互作用
   图4A是作者寻找circ-真人投注平台相互作用蛋白的方法示意图,据此找到3个潜在蛋白:EWSR1,ELAVL1和SYNCRIP。pull-down实验在未转染的细胞中只能检测到内源性和外源性circ-真人投注平台,以及EWSR1与circ-真人投注平台复合物,而另外两个蛋白或者相互作用均未能检测到(Fig 4B)。
   进一步证实circ-真人投注平台和EWSR1存在相互作用及共定位(Fig 4C-D),以及RNA电泳迁移率检测和GST标记证实EWSR1蛋白与circ-真人投注平台相互作用,且是与的RNA识别基序(RRM)域而不是与p200 真人投注平台或CASP转录本相互作用(Fig 4E-F)。以上结果表明circ-真人投注平台与EWSR1蛋白在NB细胞直接相互作用。


5、Circ-真人投注平台促进了EWSR1介导的MAZ活化
   为进一步研究circ-真人投注平台的靶基因,作者进行了RNA-seq,发现过表达circ-真人投注平台后,IMR32细胞中有781个上调基因和434个下调基因(Fig 5A)。从中筛选到5个差异显著的转录因子,然后从BioGRID数据库中提取的与EWSR1相互作用的蛋白做进一步的重叠分析,发现MAZ蛋白是参与这一过程的唯一转录因子(Fig 5B)。此外,标记MAZ的锌指结构域与EWSR1的相互作用是必需的,但不是N端或C端。实验发现,circ-真人投注平台的过表达或敲除相应增加或减少了IMR32和SH-SY5Y细胞中EWSR1和MAZ的相互作用(Fig 5C和D)。
   在IMR32和SH-SY5Y细胞中,circ-真人投注平台的过表达或敲除相应增强和减少了MAZ与这5个靶基因启动子的结合,而当EWSR1的沉默或过表达则可以消除这些作用(Fig 5E)。荧光素酶实验显示野生型真人投注平台,MAZ结合位点的启动子活性受circ- 真人投注平台异位表达或敲低的影响而升高或降低,而突变型则不受影响(Fig 5F)。此外,稳定转染circ-真人投注平台或shcirc-真人投注平台#1的IMR32和SH-SY5Y细胞中真人投注平台,S100A9,MUC4,KLF10或TXNIP的水平发生了显着变化(Fig 5G和H)。敲除或过表达EWSR1或MAZ可挽救肿瘤细胞的这些变化(Fig 5F-H)。这些数据表明,circ-真人投注平台促进了NB细胞中EWSR1介导的MAZ反式激活和靶基因的转录改变。


6、治疗肽阻断circ-真人投注平台-EWSR1相互作用
   作者基于EWSR1的RRM结构域在与circ-真人投注平台相互作用中的重要性设计了一种可穿透细胞的肽,即EWSR1抑制肽(EIP-22) ,可以阻止circ-真人投注平台-EWSR1交互作用(Fig 6A)。 用EIP-22处理SH-SY5Y细胞导致其在细胞核内明显聚集(Fig 6B)。此外,EIP-22处理减少了circ-真人投注平台和EWSR1之间的相互作用,但不减少pri-miR-222和EWSR1之间的相互作用或circACC1和AMP激活的蛋白激酶1的相互作用(Fig 6C和D)。施用EIP-22可抑制SH-SY5Y细胞的活力、增殖和侵袭(Fig 6E和F),同时改变circ-真人投注平台下游基因表达。
   静脉内施用EIP-22可显着降低小鼠皮下异种移植肿瘤的生长、重量,Ki-67增殖指数和CD31阳性微血管,改变circ-真人投注平台目标基因的表达,并降低葡萄糖摄取,乳酸盐产生和ATP水平(Fig 6G)。此外,施用EIP-22可减少小鼠肺转移量,并延长裸鼠的存活时间(Fig 6H)。这些数据表明,EIP-22通过阻止circ-真人投注平台-EWSR1相互作用来抑制NB进程。

   之后,作者进一步验证了circ-真人投注平台敲除对异种移植肿瘤裸鼠的治疗效果,结果显示裸鼠的肿瘤重量和大小,Ki-67增殖指数和CD31阳性微血管都下降了,并改变了circ-真人投注平台目标基因的表达,此外,小鼠的葡萄糖摄取,乳酸盐产生,ATP水平,肺部转移都显著下降。以上表明,在小鼠体内,慢病毒介导的circ-真人投注平台敲低可抑制好氧真人投注平台和NB的进展。
   总之,本文确定了真人投注平台为转录因子,可促进NB中真人投注平台基因ENO1,GPI和PGK1的表达。证明circ-真人投注平台与EWSR1蛋白相互作用以增加MAZ反式激活,后者随后调节真人投注平台和其他与顺式和反式与肿瘤进展相关的基因的转录(Fig 6I),例如S100A9、MUC4、KLF10和TXNIP。本文中circ-真人投注平台 / EWSR1 / MAZ轴的发现代表了对肿瘤进行治疗性干预前进了有希望的一步。
参考文献:
   Li Huanhuan., Yang Feng., Hu Anpei., Wang Xiaojing., Fang Erhu., Chen Yajun., Li Dan., Song Huajie., Wang Jianqun., Guo Yanhua., Liu Yang., Li Hongjun., Huang Kai., Zheng Liduan., Tong Qiangsong.(2019). Therapeutic targeting of circ-真人投注平台/EWSR1/MAZ axis inhibits glycolysis and neuroblastoma progression. EMBO Mol Med, 11(12), e10835. doi:10.15252/emmm.201910835

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