抑制结直肠癌的进展——m6A是关键
栏目:最新研究动态 发布时间:2020-02-21
直肠癌是指从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌,是消化道最常见的恶性肿瘤之一。直肠癌位置低,容易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断......

   直肠癌是指从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌,是消化道最常见的恶性肿瘤之一。直肠癌位置低,容易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断。但因其位置深入盆腔,解剖关系复杂,手术不易彻底,术后复发率高。YAP活化是结直肠癌(CRC)等肿瘤发生发展的关键因素。然而,目前尚不清楚N6-Methyl腺苷(m6A)是否修饰了lon的转录本。 G非编码RNA(LncRNAs)可调节YAP在肿瘤进展过程中的活化。2019年10月16日发表于 Mol. Cancer的一篇文章‘Long noncoding RNA GAS5 inhibits progression of colorectal cancer by interacting with and triggering YAP phosphorylation and degradation and is negatively regulated by the m6A reader YTHDF3’(影响因子: 10.679),主要研究了LncRNAs与m6A修饰在YAP信号传递和CRC进展中的功能联系。
结果:
一、与YAP相互作用的lncRNA的筛选和鉴定

   在八种不同的CRC细胞系中分析GAS5真人投注网站与CRC细胞中的YAP真人投注网站呈负相关。当GAS5被抑制时,核YAP蛋白会积累,而当GAS5过真人投注网站时,核YAP蛋白会下降。与YAP相互作用的lncRNA的候选物数量,并发现GAS5与YAP直接相互作用并抑制YAP的核积累。



二、GAS5与YAP蛋白相互作用的生化特征
   GAS5突变体Δ3与YAP结合的效率与全长GAS5一样有效,而其他突变体完全失去了其结合能力,表明与YAP结合需要GAS5的262-480位核苷酸。GAS5与YAP的171-263个氨基酸(aa)区结合(图2j)该区域编码称为WW域的结构域,图2k显示了YAP GAS5结合复合物的结构。利用两种独立的方法,包括生物层干涉法(BLI)分析,RNA荧光原位杂交(RNA FISH)和免疫荧光共染色测定法,以鉴定lncRNA GAS5与YAP之间的相互作用。进行了BLI分析,以检验YAP–GAS5复合物与Fortebio Octet系统的结合亲和力。生化映射表明,GAS5直接与YAP的WW域相互作用,以促进内源性YAP从细胞核到细胞质的转运。                                                                            


三、GAS5促进YAP磷酸化,以促进其泛素化和降解
   GAS5-/-降低了丝氨酸127处的YAP磷酸化水平,上调了YAP目标基因CTGF的真人投注网站。由于GAS5的上调显着抑制了YAP的总蛋白水平,而使YAP的mRNA水平保持不变,GAS5过真人投注网站细胞中多泛素化的YAP蛋白显着增加。与全长GAS5一样,GAS5突变体-Δ3的过度真人投注网站成功地促进了YAP磷酸化,而其他突变体则完全丧失了促进YAP磷酸化的能力(图3f)。在YAP抑制和GAS5上调组中,针对差异真人投注网站基因的KEGG通路分析的相交分析表明,共有543个共同目标高度重叠,主要在同一方向和丰富了Hippo途径,强烈支持GAS5在YAP信号传导中的关键作用(图3h-i)。GAS5通过促进YAP磷酸化和胞质螯合以促进其泛素化和降解来抑制YAP信号传导。


四、LncRNA GAS5通过体内外YAP失调抑制大肠癌进展
   为了研究GAS5在CRC进展中的作用在体外和体内,进行构建稳定地过真人投注网站GAS5或与YAP共转染的CRC细胞系。GAS5的过真人投注网站显着抑制了CRC细胞的增殖和侵袭能力,而增加的YAP真人投注网站成功逆转了GAS5介导的对CRC细胞增殖的抑制作用。体内实验显示GAS5的过度真人投注网站显着损害了肿瘤的生长,同时伴随着细胞活力和肿瘤体积的下降。说明GAS5通过在体外和体内抑制YAP信号传导来抑制CRC进展。


五、YTHDF3是YAP的新型靶标,可在体外和体内受GAS5调控
   由于YAP的失调对CRC的病理生物学和进展具有重要意义,因此进行RNA干扰介导的YAP敲除,以发现CRC肿瘤进展的潜在新靶标。 YAP的过真人投注网站增加了YTHDF3的真人投注网站以及CTGF和CYR61的真人投注网站。 CRC细胞中,YAP和YTHDF3之间的mRNA和蛋白真人投注网站呈正相关(图5g,h),YTHDF3是一个新颖的靶标YAP。YAP与YTHDF3的启动子结合,YAP共转染到CRC细胞中,YTHDF3启动子的荧光素酶活性大大增强,而YAP特异性siRNA显着抑制了荧光素酶活性(图5j)。

   功能获得和功能丧失分析表明,YTHDF3的敲低取消了YAP介导的CRC细胞增殖和侵袭的促进作用, GAS5的过真人投注网站抑制了YTHDF3和CTGF的真人投注网站,而YTHDF3的上调逆转了GAS5介导的YTHDF3和CTGF的抑制作用。功能测定表明,GAS5的上调显着抑制了CRC细胞的增殖和侵袭能力,而YTHDF3的共转染逆转了GAS5介导的CRC细胞增殖的抑制作用。肿瘤皮下生长和肺转移异种移植小鼠模型表明,YTHDF3的过真人投注网站导致肿瘤生长速率和肺部定植能力的显着加速,从而逆转了由GAS5过真人投注网站导致的肿瘤抑制(图6f和h)。表明YTHDF3是YAP的新靶标,而GAS5通过抑制YAPDF介导的YTHDF3在体内和体外的真人投注网站来抑制CRC细胞的增殖和侵袭。


六、YTHDF3结合m6A修饰的GAS5并促进GAS5的衰变
   由于在GAS5中积累了m6A修饰,YTHDF3敲低导致GAS5真人投注网站显着增加,表明YTHDF3在m6A介导的GAS5降解中起主要作用。YTHDF3选择性结合m6A修饰的GAS5并以甲基化依赖性方式调节GAS5降解,为CRC进展中GAS5失调提供了基础。


七、CRC患者肿瘤中LncRNA GAS5真人投注网站与YAP和YTHDF3蛋白水平呈负相关
   与邻近组织相比,CRC组织中GAS5的真人投注网站降低,而GAS5较低的真人投注网站与CRC患者肿瘤组织中YAP和YTHDF3的真人投注网站升高有关。后发现YTHDF3的高真人投注网站是CRC患者总体生存不良的重要预后因素,为CRC治疗提供了一种有希望的方法。


结论:
   lncRNAs和CRC中YAP信号的m6A修饰之间的功能联系。LncRNA GAS5直接与YAP结合,促进其磷酸化和泛素介导的降解,从而减弱YTHDF3的YAP介导转录,后者可逆、选择性地与m6A甲基化的GAS5结合,触发其衰变,形成负反馈环。该实验提出了lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3轴在CRC进展中的负功能环,这可能为CRC的治疗提供一种有前景的方法。

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