新发现:circTP63作为竞争性内源RNA通过上调FOXM1真人投注网站而促进肺鳞癌的发生
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-12-19
非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要组织学类型,其中肺鳞状细胞癌和肺腺癌是主要的亚型......

   非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要组织学类型,约占80-85%,其中肺鳞状细胞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)是主要的亚型,最近,针对特定基因突变的靶向药物的开发极大地改善了晚期LUAD患者的治疗,,由于铂类化疗对LUSC的疗效降低所致,一小部分的LUSC港驱动基因突变,导致5年生存率低于5%。因此深入探索LUSC发生发展的分子机制,寻找治疗LUSC的潜在分子靶点变得尤为重要。近年来,circRNA作为一种新型的调控RNA分子,引起了广泛的关注,随着对其结构和功能深入认识,发现circRNA在人类疾病(动脉粥样硬化血管疾病、神经疾病、心脏病和癌症)等疾病中起重要作用。circRNA可作为竞争性内源RNA(ceRNA)在多种类型癌症中发挥功能,在肺癌中,LUAD相关的circRNAs被陆续发现,但是,尚未全面探讨circRNA在LUSC中的作用和机制。
    7月份,覃文新研究员课题组与姜丽岩教授团队合作发表一篇“circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1.”的SCI文章,IF= 11.878。该研究在五个LUSC病人标本中研究了circRNA和mRNA的真人投注网站谱,鉴定circTP63在LUSC中显著上调,进一步发现circTP63与LUSC病人的肿瘤大小和TNM分期呈正相关,而且体内外功能实验表明circRNA过真人投注网站促进LUSC细胞的周期进程和增殖。机制上,发现circRNA充当ceRNA来上调FOXM1来促进细胞增殖,竞争性结合miR-873-3p,进而破坏miR-873-3p对其靶基因FOXM1的抑制作用,从而FOXM1真人投注网站上调,进而促进其下游分子CENPA和CENPB的真人投注网站,最终影响细胞周期和增殖。简言之,该研究首次发现circTP63 通过ceRNA的机制驱动LUSC的发生发展,为LUSC的治疗提供了新策略。
技术路线:


一、筛选肺鳞癌关键环状RNA分子-circTP63
   通过q-PCR实验证实了circTP63在肺鳞癌组织中明显上调,而且circTP63的真人投注网站与TB63真人投注网站呈正相关。显然circTP63在LUSC中上调,重要的是, circTP63在LUSC组织与LUSC患者肿瘤较大小和更高的TNM分期呈正相关,并且其调节与以后的临床阶段相关。


二、肺鳞癌细胞中circTP63的鉴定
   circTP63来自TP63基因的外显子10至11,长度为295 nt。Northern印迹实验证明circTP63在295nt位置。circTP63转录本的半衰期超过24小时,比TP63更稳定(图  2d)。circTP63转录本偏好在细胞质中(图  2e)。在六个LUSC细胞系和两个人类正常肺细胞系中的内源性circTP63真人投注网站。我们发现circTP63在LUSC细胞系中上调相比于人正常肺细胞系(补充图  3a)。基于此结果,选择SW900和H1703细胞用于circTP63功能丧失检测,而选择H226和H2170细胞进行功能增益检测。这些结果进一步证实了circTP63作为circRNA 的特征。


三、体内外功能实验证明circTP63促进肿瘤细胞的增殖和生长。
   A和b. circTP63基因沉默后与过真人投注网站后qRT-PCR表明TP63的真人投注网站不受circTP63的影响;c和d. circTP63沉默或过真人投注网站后表明circTP63促进细胞增殖;e和f. circTP63沉默或过真人投注网站后表明促进细胞周期;g和h. circTP63沉默和过真人投注网站后表明circTP63增加肿瘤体积和重量。这些发现表明, circTP63可能在体外和体内在LUSC中发挥致癌作用。


四、circTP63在肺鳞癌中的分子机制。
   A和B.circTP63和mRNAs共真人投注网站网络图,发现了25个潜在的mRNA参与肺鳞癌的发展,其circTP63中FOXM1,KIFI8B和BRCA1是预测前三共真人投注网站的mRNA,而且在LUSC中FOXM1是明显上调8倍多。C.进一步确认了上调水平35个配对LUSC样品中的FOXM1的真人投注网站。D.
与KIF18B或BRCA1相比,circTP63的真人投注网站与FOXM1正相关.E. OXM1的八个成对LUSC样品的蛋白水平,然后用的转录水平的相关性的分析circTP63表明,FOXM1在LUSC组织显著上调并与正相关circTP63。F.通过qRT-PCR和Western blots验证了circTP63沉默明显降低FOXM1 mRNA和蛋白的真人投注网站水平,同时FOXM1沉默和过真人投注网站明显影响细胞的生长和细胞的周期发展,因此作者说明circTP63可能通过靶向FOXM1调控LUSC细胞的增殖。


五、circTP63调控FOXM1的真人投注网站。
   作者通过生信分析构建circTP63-miRNAs-FOXM1网络图,发现circTP63和FOXM1的共同结合位点。为了进一步证实circTP63可以作为ceRNA来调节FOXM1的真人投注网站,我们通过拷贝数测量了LUSC细胞系中circTP63和miR-873-3p的绝对真人投注网站水平。结果显示,在大多数测试的LUSC细胞系中,circTP63的绝对真人投注网站量远高于miR-873-3p(补充图  6d),这表明circTP63对海绵miR-873-3p是合理的。然后,我们使用生物素偶联的miR-873-3p模拟物进行了下拉实验,以检测circTP63和FOXM1的竞争结合活性到的miR-873-3p在H2170细胞。我们注意到,的近三倍富集circTP63和的近6倍富集FOXM1在的miR-873-3p捕获分数与阴性对照相比荧光酶实验分析表明miR-873-3p显著性降低circTP63的荧光活性真人投注网站,并且RIP也显示下拉的分子中富含大量的circTP63。利用RNA pull down验也发现circTP63和FOXM1复合物富集大量的miR-873-3p,过真人投注网站miR-873-3p同系物显著降低circTP63和FOXM1荧光素酶活性。circTP63充当ceRNA吸附miR-873-3p上调FOXM1的真人投注网站,影响肺鳞癌发展。


六、circTP63促进肺鳞癌细胞的周期发展。
   FOXM1是细胞周期调节器,控制细胞从G1期到S期以及到M期转变的过程。作者选择了FOXM1可能的8个下游靶基因,通过q-PCR检测到circTP63过真人投注网站时CENPA、CENPB和CCNB1显著性上调,回补实验和表型实验都证实了CENPA和CCNPB能够影响细胞的增殖。

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