m6A甲基化与肥胖治疗
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-12-18
m6A在脂肪发生过程中起着重要作用。然而,其机制在很大程度上仍不清楚......

   m6A在脂肪发生过程中起着重要作用。然而,其机制在很大程度上仍不清楚。在这里,小编与大家分享一篇近期发表于AUTOPHAGY的文章“m6A mRNA methylation controls autophagy and adipogenesis by targeting Atg5 and Atg7”。我们证明了m6A通过靶向Atg5和Atg7在调控自噬和脂肪生成方面发挥着关键作用。机制上,众所周知的m6A去甲基酶FTO的下调降低了ATG5和ATG7的真人投注网站,导致自噬体形成的衰减,从而抑制了自噬和脂肪生成。

结果:
1.FTO促进自噬,进一步促进脂肪生成

   为了探索FTO在自噬中的作用,我们首先对3T3-L1细胞进行了功能缺失的研究。western blot实验表明,与对照细胞相比,FTO沉默显著降低了LC3-II:I比值,增加了SQSTM1水平,表明自噬体形成缺乏稳态(图1A)。相反,HA标记的FTO过真人投注网站显著提高了LC3-II:I比值,减少了SQSTM1真人投注网站,表明FTO与自噬呈正相关。此外,免疫荧光检测显示,HA-FTO过真人投注网站后形成较多的LC3小点(图1B,C)。我们用透射电镜分析了脂肪形成过程中自噬体的形成。发现FTO的沉默降低了自噬体的数量,表明自噬的激活程度降低。相反,FTO的过真人投注网站增加了细胞内自噬体的数量(图1D,E)。为了确定自噬是否受FTO过真人投注网站的影响,对照组和过真人投注网站的细胞分别使用或不使用其他自噬抑制剂治疗。这进一步证实FTO促进自噬激活(图1F,G)。
为了探讨FTO是否通过自噬途径影响脂肪生成,在脂肪生成过程中,对照组和FTO过真人投注网站的3T3-L1和猪前脂肪细胞分别使用或不使用自噬抑制剂。我们观察到3-MA和 Baf A1治疗可以逆转增强的自噬,脂肪形成和FTO过真人投注网站细胞的甘油三酯积累(图1H-J)。与表型一致,脂肪细胞标记的mRNA和蛋白水平包括Pparg,Fabp4和Cebpa在FTO过真人投注网站细胞明显升高,通过3-MA或Baf A1处理可将FTO下调至正常水平(图1K,L)。这些结果表明FTO通过促进自噬促进脂肪细胞分化。


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2.FTO的下调降低了ATG5和ATG7的真人投注网站,但没有降低ULK1的真人投注网站
   
为了确定自噬中FTO的潜在靶基因,我们首先利用qPCR分析比较FTO敲低后自噬相关基因的mRNA真人投注网站情况。结果显示,在FTO敲除后,Atg5和Atg7的mRNA水平显著降低,而Ulk1没有变化(图2A)。另外,FTO的下调显著下调了ATG5和ATG7蛋白水平。相反,我们发现ULK1和其他自噬相关蛋白,如ATG12和ATG16L1,并没有发生显著的变化(图2B)。此外,我们检测了ATG5和ATG7在脂肪细胞分化过程中的真人投注网站谱,发现他们两个都在早期增加,然后下降(图2C)。这些数据表明,Atg5和Atg7可能是FTO的靶基因。
为了检测ATG5和ATG7对自噬和脂肪生成的影响,我们分别用ATG5和ATG7 siRNA处理3T3-L1前脂肪细胞,并使用western blot检测其敲除效率。结果表明,LC3II:I的比值在ATG5和ATG7基因敲除后下降,FTO蛋白真人投注网站未发生变化(图2D,E),这与FTO与ATG5、ATG7的上游下游关系一致。此外,我们发现,与对照组相比,FTO、ATG5和ATG7的缺失均显著抑制脂肪生成和甘油三酯积累(图2F-H)。而且FTO、ATG5或ATG7敲低均下调了脂肪细胞标记基因的真人投注网站水平(图2I,J)。这些结果表明ATG5和ATG7对3T3-L1前脂肪细胞的自噬和脂肪生成具有重要的功能。因此,我们将重点放在这两个FTO的潜在目标Atg5和Atg7上进行进一步的研究。

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3.FTO通过靶向ATG5和ATG7影响自噬和脂肪生成
   
为了证实FTO是否通过影响ATG5和ATG7的真人投注网站而影响自噬和脂肪生成,我们首先验证了FTO的过真人投注网站显著提高了ATG5和ATG7的mRNA水平(图3A)。接下来,我们进行了抢救实验,观察到沉默ATG5可以逆转FTO过真人投注网站3T3-L1细胞中上调的LC3-II:I比值(图3B)。与ATG5相似,ATG7缺失也恢复了扩增的LC3-II:I比值(图3C),表明FTO通过调控ATG5和ATG7真人投注网站影响自噬。已有研究报道,ATG5和ATG7在前脂肪细胞中的下调通过抑制PPARG和CEBPA的真人投注网站,抑制自噬,降低CEBPB的水平,阻碍脂肪分化计划的启动。这增加了FTO通过Atg5和Atg7-Cebpb信号调控脂肪生成的可能性。如我们所料,我们发现FTO的强制真人投注网站促进了CEBPB蛋白的真人投注网站,而ATG5和ATG7的缺失则逆转了CEBPB的真人投注网站(图3D)。此外,敲低ATG5 和ATG7可恢复FTO过真人投注网站促进的3T3-L1细胞的脂肪生成和甘油三酯积累(图3 E-G)。FTO过真人投注网站细胞中Pparg、Fabp4和Cebpa 的真人投注网站水平的升高也被逆转(图3H,I)。总的来说,FTO通过介导Atg5和Atg7-Cebpb信号轴促进脂肪生成。

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4.FTO以m6A依赖的方式调控ATG5和ATG7真人投注网站
   为了进一步阐明FTO在自噬调控中的潜在分子机制,我们构建了野生型(FTO- wt)和催化突变体FTOR96Q (FTO- mut)质粒,以确定是否需要FTO的去甲基酶活性。液相色谱串联质谱证实FTO-WT或FTO-MUT异位真人投注网站对细胞m6A水平的影响(图4A)。体外真人投注网站的FTO-WT显著增加了3T3-L1和猪脂肪细胞的LC3-II:I比值(图4B),这意味着FTO以去甲基化酶活性依赖的方式调节自噬。一致的是,真人投注网站FTO-WT的细胞在免疫荧光检测中显示LC3斑点显著增强(图4C,D)。此外,与FTO-MUT或空载体相比,FTO-WT的异位真人投注网站增加了自噬体的数量(图4E,F)。这些结果表明,FTO的去甲基化活性是前脂肪细胞自噬所必需的。接下来,我们研究了FTO是否通过去甲基化影响ATG5和ATG7的真人投注网站。与FTO-MUT或空载体相比,体外真人投注网站的FTO-WT增加了ATG5和ATG7的蛋白和mRNA水平(图4G)。另外,在Atg5和Atg7的3’UTR处发现m6A修饰(图4I)。我们发现,通过敲低FTO可以增加3T3-L1和猪前脂肪细胞的m6A水平(图4J)。此外,MeRIP-qPCR检测显示,FTO敲除显著提高了Atg5和Atg7 mRNA转录本的m6A水平(图4K)。我们用RIP-qPCR,观察到Atg5和Atg7分别与3T3-L1中HA标记的FTO和猪前脂肪细胞中FLAG标记的FTO相互作用,提示Atg5和Atg7是FTO的直接靶点(图4L)。更重要的是,为了评估m6A对靶标mRNA的修饰是否对FTO介导的基因调控是必要的,我们对3T3-L1细胞进行了双荧光素酶报告基因和诱变实验。FTO-WT的强制真人投注网站显著促进了Atg5和Atg7的野生型3’UTR片段的活性(图4M)。当m6A位点发生突变时,这种增加被消除,说明FTO通过m6A依赖方式调控ATG5和ATG7的真人投注网站。此外,染色分析显示,FTO- WT促进脂肪细胞分化和甘油三酯积累(图4N,P),证实FTO的去甲基化活性是脂肪生成所必需的。

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5.YTHDF2通过m6A依赖机制介导ATG5和ATG7的稳定性和真人投注网站
   
为了进一步解释m6A甲基化与FTO靶基因蛋白丰度之间的负相关关系,我们首先研究了ATG5和ATG7的真人投注网站是否受到YTHDF2或YTHDF1的影响。与对照组相比,YTHDF2的过真人投注网站显著降低了ATG5和ATG7蛋白水平(图5A)。而YTHDF1的强制真人投注网站对ATG5和ATG7的真人投注网站无影响(图5B),说明ATG5和ATG7是YTHDF2的靶点。另外,通过RIP-qPCR检测,我们进一步证实了Atg5和Atg7在3T3-L1和猪前脂肪细胞中都与标记为FLAG的YTHDF2相互作用(图5C)。接下来,我们测试了Atg5和Atg7 mRNA上的m6A修饰是否对YTHDF2介导的基因调控至关重要。双荧光素酶检测显示异位YTHDF2显著下调携带野生型Atg5和Atg7片段的荧光素酶活性(图5D)。为了研究YTHDF2是否通过介导mRNA的衰减来控制Atg5和Atg7的真人投注网站,我们对3T3-L1细胞进行了功能缺失研究。与对照细胞相比,YTHDF2的敲低提高了Atg5和Atg7的mRNA水平(图5E)。mRNA稳定性分析显示,YTHDF2的缺失延长了Atg5和Atg7 mRNA转录本的半衰期(图5F)。此外,通过强制真人投注网站YTHDF2,可以部分逆转FTO过真人投注网站3T3-L1时ATG5和ATG7蛋白水平的升高(图5G)。YTHDF2过真人投注网站也部分逆转了FTO过真人投注网站细胞中LC3-II:I比值的升高。此外,异位真人投注网站YTHDF2可以逆转FTO过真人投注网站导致的脂肪生成和甘油三酯积累(图5H-J)。



6.FTO可降低小鼠白色脂肪量,抑制ATG5和ATG7依赖的自噬
   为了研究FTO在体内脂肪组织中的作用,我们将Ftoflox/flox小鼠与Fabp4-Cre小鼠杂交,建立了脂肪选择性FTO敲除小鼠(FTO-ako)模型。FTO-ako小鼠的白色脂肪组织中FTO的真人投注网站被有效地删除(图6A)。与胎鼠对照小鼠相比,fto-AKO小鼠不受普通饲料或高脂饮食(HFD)诱导的体重增加的影响,而两组之间的食物摄入量没有显著差异(图6B,C)。与对照组小鼠相比,fto-AKO小鼠取食普通食物和高脂饮食上都明显变瘦(图6D)。另外,fto-AKO小鼠的腹股沟脂肪和性腺脂肪垫的质量分别显著低于对照组小鼠(图6E,F)。haematine和伊红染色显示,取食HFD的小鼠脂肪细胞具有典型的结构,几乎整个细胞被一个大的脂滴所占据(图6G,H)。相反,FTO缺乏会导致多腔和较小的脂肪细胞。此外,喂食HFD的fto-AKO小鼠的血糖水平和血清甘油三酯水平明显低于对照组小鼠(图6I,J)。为了研究FTO是否影响体内自噬,我们首先检测了对照组和FTO-ako小鼠WAT中LC3-II:I和SQSTM1的真人投注网站水平。有趣的是,脂肪选择性缺失的Fto显著减弱了LC3-II:I比值,增加SQSTM1蛋白丰度(图6K)。与体外研究一致,FTO缺乏减少ATG5和ATG7的蛋白和基因真人投注网站(图6K,L)。综上所述,这些结果表明,脂肪细胞选择性敲除fto可以降低WAT的量,并抑制ATG5和ATG7依赖的小鼠自噬。


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总结:
   我们的研究表明,FTO在m6A-YTHDF2依赖机制中,在促进自噬和脂肪生成方面发挥着重要作用。我们的研究强调了m6A甲基化机制在自噬中的功能的重要性。这些发现为FTO和m6A修饰调节自噬和脂肪生成的分子机制,以及预防和治疗肥胖的治疗策略的发展提供了深入的了解。

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