新的单真人投注表面蛋白检测技术实现复杂真人投注组分精准分析
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-11-27
越来越多的研究揭示了真人投注在细胞间通讯中的作用,同时也对真人投注作为疾病诊断和治疗的分子标志物进行了探索......

   真人投注是细胞分泌的30-100nm的脂质双层膜结构的囊泡,内含蛋白质、核酸、脂质等成分,也是体液中的重要信息物质。越来越多的研究揭示了真人投注在细胞间通讯中的作用,同时也对真人投注作为疾病诊断和治疗的分子标志物进行了探索。但其中仍存在的一个重要问题是如何对体液中复杂的真人投注组成进行精准的分析和分类,并从占比极小的疾病相关真人投注中获取更准确的信息。此前,在nature biotechnology杂志上发表了称为nano-plasmonic exosome (nPLEX) assay对该问题进行了探索[1]。
   在Nature communication杂志最新一期中,研究人员针对这一问题从另一个角度开发了proximity-dependent barcoding assay (PBA)方法。让我们一起了解一下吧。

   该方法希望通过各种真人投注表面蛋白的差异,分析各种真人投注的含量、该方法流程图如图一所示。首先筛选得到针对各种真人投注表面蛋白的高亲和力、特异性抗体。然后使用一段特定的寡核苷酸与抗体偶连。在该段序列上,含有标记特定抗体(蛋白)的protein Tag序列,即最终测序结果中该序列代表某个真人投注表面含有该蛋白质。此外,在protein Tag序列后含有随机的8-nt random unique molecular identifier (UMI)序列,称为molecule Tag。该序列用来区分PCR扩增后的每一个特定蛋白质分子[2]。该复合物被称为PBA probes。与此同时,作者设计了含有标记单个真人投注的complex Tag的环状DNA分子,并通过适当的Roling circle amplification(RCA)获得约几百拷贝的RCA产物。即特定complex Tag序列代表某个真人投注。

                                 图1 proximity-dependent barcoding assay (PBA)方法流程图
   待分析的真人投注孵育后与PBA probes后,接种在特定的96孔微量滴定板上。在该捕获设备上,已经以设计好的稀疏的密度偶连了cholera toxin subunit B (CTB);该蛋白可以结合真人投注膜上的GM1 gangliosides从而捕获真人投注。接下来,将RCA产物加入体系中并使其通过互补序列与probes结合。最后通过PCR扩增和建库测序便可读取所有的真人投注上检测蛋白的含量。
 
   对这一新开发的实验方法,作者首先检测了它的检测准确度。通过链霉素生物学系统模拟检测实验,作者使用了四种protein Tag进行了测试。在分开孵育和混合孵育后作者检测了四种protein Tag极其molecule Tag的比例。检测结果与理论相符。protein Tag检测比例与混合比例一致。Molecule Tag数也与理论比例一致。饱和情况下,链霉素与生物素结合比例为1:4。

                                          图2 链霉素模拟实验检测PBA准确性
 
  在采用模拟实验检测该方法后,作者使用真人投注标志蛋白CD9和CD63抗体对该方法进行了进一步验证。在tag A-C和tag B-D分别孵育时,只能检测到同时含A-C和B-D的蛋白标记。当四种tag标记的抗体同时孵育时,则各种tag组合均能检测到。这说明该方法在检测真人投注时同样适用。

                                           图3 CD9和CD63检测验证PBA准确性
 
   接下来作者使用了该方法对复杂的混合真人投注进行了研究。作者共检测了16中细胞系上清真人投注和2中体液真人投注的混合体系中的38个已报道的真人投注蛋白含量。图4a中热图展示了各个蛋白的含量分布。在使用3个或三个以上的蛋白分子数数据进行降维分析后,作者发现这些蛋白含量差异能在一定程度上区分不同来源的真人投注。

                                    图4 PBA分析18种真人投注混合体系中38个蛋白质的含量差异

   最后,作者比较了混合样品中K562细胞、前列腺小体、健康者血清中真人投注蛋白的差异。在图5a中,作者展示了鉴定的主要在K652或前列腺小体真人投注中存在的蛋白质组合。

                               图 5 K562和前列腺小体真人投注对比健康血清中真人投注的特异蛋白质组合分析
小结:
   虽然该方法仍存在着一些限制。比如对抗体亲和力、特异性要求高;测序深度要求很大等。但对检测高异质性的真人投注中特定组分的变化和更有效的对疾病进行早期诊断提供了很好的技术手段。
参考文献:
1.Im, H., et al., Label-free detection and molecular profiling of exosomes with a nano-plasmonic sensor. Nat Biotechnol, 2014. 32(5): p. 490-5.
2. Kivioja, T., et al., Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods, 2011. 9(1): p. 72-4.

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