环状AKT3 RNA编码的蛋白抑制胶质母细胞瘤的致瘤性
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-11-18
circRNA Circ-AKT3编码的蛋白通过与活化的PDK1竞争来阻断AKT thr-308磷酸化,达到抑制GBM细胞的增殖......

   胶质母细胞瘤(GBM)是最致命的肿瘤之一,尽管治疗手段多样,但是GBM患者的中位生存时间仅为12-14个月。近日,来自中山大学附属第一医院的研究团队在Molecular Cancer上发表了一篇题名为:A novel tumor suppressor protein encoded by circular AKT3 RNA inhibits glioblastoma tumorigenicity by competing with active phosphoinositide-dependent Kinase-1的文章。该文章主要讲述了circRNA Circ-AKT3编码的蛋白通过与活化的PDK1竞争来阻断AKT thr-308磷酸化,达到抑制GBM细胞的增殖,抗辐射性和致瘤性。


一、Circ-AKT3在GBM样品和细胞系中低真人投注平台
   对GBM癌和癌旁组织进行circRNA测序,GBM癌组织中3363个circRNA真人投注平台上调,3072个下调。三个circRNA-AKT3(hsa_circ_0017250,hsa_circ_0112784和hsa_circ_0112781)在测序数据中发现,只有hsa_circ_0017250含有完整ORF。肿瘤组中hsa_circ_0017250(circ-AKT3)的水平明显低于正常组,因此选取circ-AKT3进行后续研究。
  Circ-AKT3由AKT3基因的第3外显子到第7外显子生成,全长524 nt,PCR产物和Sanger测序证实了Circ-AKT3圆形结构。与线性形式的AKT3 mRNA相比,CIRC-AKT3在RNA酶作用下具有更长的半衰期。FISH结果表明,CIRC-AKT3在星形胶质细胞(NHA)的细胞质中,核质分离PCR结果验证这一结论。利用Northern印迹检测过真人投注平台的circ-AKT3或加circ-AKT3 shRNA转染的NSC和NHA细胞中的circ-AKT3的真人投注平台。通过qRT-PCR方法在患者组织和细胞系中验证circ-AKT3和线性AKT3 RNA真人投注平台水平,与NSC和NHA细胞相比,GBM和GICs细胞真人投注平台的circ-AKT3水平较低。线性AKT3的mRNA有在GBM细胞和临床样品中低真人投注平台。

二、Circ-AKT3编码174个氨基酸(aa)的新蛋白AKT3-174aa
   CIRC-AKT3具有预测的ORF,可以通过使用包含起始和终止密码子“UAAUGA”的片段编码174个氨基酸的蛋白质。使用双荧光素酶检测CIRC-AKT3的IRES活性,在IRES的驱动下,174个氨基酸的产物涵盖了与AKT3蛋白相同的62–232氨基酸序列,并带有一个特殊的“Ans Ala Ser”C端。使用的抗体结合AKT3蛋白的中间部分,抗体可以识别AKT3和AKT3-174aa。AKT3-174aa在GBM细胞和组织中低真人投注平台。使用CIRC-AKT3的过真人投注平台质粒,证实174个氨基酸的预测的蛋白通过CIRC-AKT3编码。再低CIRC-AKT3真人投注平台的细胞系中转染circ-AKT3和线性化的AKT-174aa质粒,均产生了预测的AKT-174aa条带。与此相反,在两个shRNA敲低CIRC-AKT3的NHA细胞中,AKT3-174aa真人投注平台减少,不影响线性AKT3的mRNA编码的蛋白真人投注平台。SDS-PAGE电泳后使用质谱技术确定了AKT3-174aa肽段的分子量。这些结果证明,circ-AKT3编码这种174个氨基酸的新蛋白,我们称之为AKT3-174aa。免疫荧光结果显示,AKT3-174aa在U251细胞的细胞质中存在。在临床样本中,AKT3-174aa真人投注平台与GBM患者的预后呈负相关,线性AKT3的真人投注平台水平与GBM患者总体存活的物相关性。这表明AKT3-174aa可以是用于GBM患者的预后标志物

三、AKT3-174aa作为抑制恶性表型的GBM肿瘤抑制剂
   在SW1783和Hs683神经胶质瘤细胞系中circ-AKT3的敲低只能减少AKT3-174aa的真人投注平台,而不减少AKT1,AKT2和AKT3的真人投注平台。在U251和U373细胞中过真人投注平台circ-AKT3,只增加现行AKT3-174aa的真人投注平台,并不影响AKT1,AKT2和AKT3的真人投注平台。并且过真人投注平台circ-AKT3的U251和U373细胞增殖能力减弱,敲低CIRC-AKT3促进SW1783和HS683细胞生长。在克隆形成实验中AKT3-174aa与细胞集落形成呈负相关。AKT3-174aa过真人投注平台增强了GBM细胞放射敏感性,AKT3-174aa敲低加强星形细胞瘤细胞的放射不敏感性。这些数据结果支撑了AKT3-174aa的肿瘤抑制的作用。

四、AKT3-174aa发挥生物学功能
   为了进一步验证AKT3-174aa而不是circ-AKT3发挥上述功能,使用线性化AKT3-174aa质粒在稳定敲除circ-AKT3的SW1783和Hs683细胞中恢复AKT3-174aa的真人投注平台。AKT3-174aa的真人投注平台逆转由CIRC-AKT3稳定敲除引起的恶性表型。相反,过真人投注平台起始密码子突变的CIRC-AKT3,并不能抑制U251和U373细胞增殖,集落形成和放射不敏感等恶性表型。以上结果证明AKT3-174aa在GBM中发挥了肿瘤抑制作用,而不是circ-AKT3。

五、AKT3-174aa抑制AKT Thr308的磷酸化
   为了研究AKT3-174aa参与的分子机制,对稳定真人投注平台circ-AKT3和circ-AKT3 IRES-mut(突变)质粒的U251和U373细胞进行RNA序列分析。在U251和U373中分别检测到共1873和2471个差异真人投注平台基因(DEG)。DEGs和KEGG分析均显示出与癌症相关途径的显着关联,包括PI3K-Akt信号通路,TNF信号通路,MAPK信号通路等。由于AKT3-174aa与AKT3共享一段相同的序列,因此首先检查了AKT3-174aa过真人投注平台或敲低细胞中AKT亚型的激活。AKT3-174aa不影响总AKT1,AKT2或AKT3的mRNA或蛋白质的真人投注平台水平;AKT3-174aa抑制AKT-的Thr308但不抑制AKT-Ser473的磷酸化。
   在人GBM中,AKT激活通常与PTEN交替相关,在AKT3-174aa过真人投注平台的U251和U373细胞和在AKT-174aa稳定敲除的SW1783和Hs683细胞中,未发现p-EGFR(thr1068)发生变化。在PTEN野生型SW1783和HS683细胞中,PTEN真人投注平台也未AKT3-174aa敲低影响。AKT3-174aa的过真人投注平台减少了AKT2和AKT3的thr-308磷酸化,但没有降低ser-473的磷酸化,这表明AKT3-174aa的影响大于AKT3。这些结果表明AKT3-174aa在p-AKT上游发挥作用,而不是影响AKT亚型本身。尽管PDK1或p PDK1真人投注平台不受AKT3-174aa的影响,但是通过使用质谱发现p PDK1是AKT3-174aa免疫沉淀复合物的潜在相互作用蛋白。在IP实验中,Flag标记AKT3-174aa可能与p PDK1相互作用。虽然pulldown实验并没有结果,但是在体外IP实验中GST-AKT3-174aa与His-PDK-1可以相互作用,这进一步证实这AKT3-174aa PDK-1互动与激活。在荧光双染中AKT3-174aa 与PDK-1共定位,表明这表明AKT3-174aa通过与对p PDK1相互作用以抑制AKT的THR-308。

六、AKT3-174aa是AKT的天然显性负调节变体
   由于AKT3-174aa与AKT3在62-232位氨基酸共有相同的序列,AKT3-174aa可能与AKT亚型竞争与p-PDK1结合。过真人投注平台AKT3-174aa后p-PDK1的活性显著抑制。此外,AKT激酶活性在U251和U373 AKT3-174aa过真人投注平台细胞中被抑制,而在SW1783和HS683 AKT3-174aa稳定敲低细胞活性增强。剂量依赖性转染CIRC-AKT3进入U251细胞,并用AKT2,AKT3和对PDK1进行免疫沉淀。随着AKT3-174aa的真人投注平台增加,P-Thr308在AKT2和AKT3的IP均降低。在剂量依赖性敲低的SW1783细胞行中结果相反。结果表明,AKT3-174aa是蛋白质诱饵,通过显性负调控限制P-AKT的异常活化。

七、AKT3-174aa在体内抑制GBM致瘤性
 
 在小鼠颅内肿瘤模型中测试AKT3-174aa的肿瘤抑制作用。AKT3-174aa过真人投注平台显著提高小鼠模型的总生存时间,与之相反敲低AKT3-174aa促进体内肿瘤形成。在小鼠异种移植肿瘤中,AKT3-174aa过真人投注平台与p-AKT-thr308的真人投注平台水平负相关;这支持了AKT3-174aa抑制AKT活化诱导的恶性表型。总之结果表明,AKT3-174aa是GBM肿瘤发生过程中PI3K / AKT信号传导的关键负调节。


结论:
   Circ-AKT3是新鉴定的AKT3转录变异体。Circ-AKT3编码AKT3-174aa,与p-PDK1相互作用。Circ-AKT3和AKT3-174aa在GBM中低水平真人投注平台,可以更容易地诱导AKT-thr308磷酸化和p-PDK1的激活。恢复AKT3-174aa的真人投注平台可在体外和体内抑制GBM的细胞增殖,存活和致瘤性。作为PI3K / AKT信号的新型负调节剂,AKT3-174aa是GBM患者的潜在预后标志物。


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