新生物信息技术-EISA:解析真人投注和真人投注后过程对基因表达变化所起的作用
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-09-17
分裂分析(EISA)是一种生物信息技术,可测量在不同条件下mRNA和前体RNA水平的变化,可以区分真人投注水平上调控的RNA或在真人投注后水平......

分裂分析(EISA)是一种生物信息技术,通过对RNA-Seq的分析,将真人投注和真人投注后效应分离开来,并将其映射到外显子和内含子。可测量在不同条件下mRNA和前体RNA水平的变化,可以区分真人投注水平上调控的RNA或在真人投注后水平——miRNA成熟或正在降解。上皮间充质转化(EMT)是一个备受关注的课题,认识其机制有助于研究肿瘤转移和药物敏感性等问题。虽然EMT受许多miRNAs和真人投注因子的调节,然而miRNAs和真人投注因子的功能很难区分,一部分原因是从测序数据集中难以直接识别miRNA靶基因,以及难以确定miRNA效应,本文主要阐述miRNAs参与EMT过程中如何在真人投注组中发挥作用,而运用了一种生物信息技术-EISA(exon-intron split analysis)。(Nucleic Acids Research,IF=11.147 ,Extensive transcriptional responses are co-ordinated by microRNAs as revealed by Exon-Intron Split Analysis (EISA))
研究背景:miR-200c是一个促间质转化上皮的 microRNA。
一、EISA成功区分真人投注和真人投注后基因调控

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      我们初步比较人乳腺上皮细胞(HMLEs)的内含子丰度的变化与活性和非活性基因的标志的一致性。

图A:一种通过TGF进入间充质状态EMT细胞模型(MesHMLE), miR-200C驱动间质向上皮转化后,前5%的真人投注上调和下调基因 (ΔI),由ChIP-Seq获得活性染色质(H3K4me3,H3K9-14ac,H3K27c-绿色)和非活性染色质(H3K27me3-红色)的标记物的相对富集。在一个跨越25个基因滑动窗口中红色/绿色阴影显示了测量的均值。(每第5个窗口绘图)。
图B:由EISA分析所有组蛋白标记与真人投注水平上的基因表达相关(大ΔI)。相反,活性基因和非活性基因的标记与真人投注后调控的基因(大ΔE-ΔI,小ΔI,图1B)的相关性小.因此,EISA度量ΔI表明了基因真人投注的影响。基于图A的ΔE-ΔI的评分。
图C:对转染miR-200C的mesHMLE细胞的RNA-seq数据进行EISA分析,以评价miR-200C相对真人投注和真人投注后效应。基于ΔE:ΔI, 真人投注后miR-200 C靶点的测量值负值。
图D:由ΔE-ΔI、ΔI、ΔE确定基因表达的累积分布(fold change),来预测响应miR-200C的靶位点。

二、miR-200c真人投注后调节EGF信号网络



      鉴于EISA能有效区分真人投注和真人投注后调节,我们关注在真人投注后下调基因。对miR-200C和预测的靶点进行分析,以及确定在HMLE系统中由miR-200C直接调控的基因和通路。

图A:通过TargetScan或MicroT-CDS预测miR-200c的靶基因,(ΔE-ΔI,前1000位真人投注后负调控基因)。通过基因本体论研究靶基因之间的关系,发现在EMT中EGFR信号通路的foid enrichment是最高的。 
图B:真人投注后下调基因的大多数是预测的高重叠和预测目标的靶基因。通过the targetscan and microT-CDS algorithms预测,miR200c和miR200c目标反应的1000、500和200个真人投注后下调的基因。
图C:在EGF信号网络3’ UTR 荧光素酶报告基因测定miR-200c靶标。
图D:在EGFR下游的信号网络中miR-200C的靶基因(蓝色阴影)。KEGG pathway显示Akt和ERK被激活。
图E:用EGF处理Meshmle细胞,Western Blot检测在miR-200c表达或不表达的情况下的EGFR、Akt、MEK和ERK(或总蛋白)的磷酸化。

三、在EMT/MET过程中Mir-200 c和TGFβ共同调节的真人投注反应。



图A:ΔE-ΔI (真人投注后),ΔI (真人投注)表示EISA定义的基因调控效应. 虽然miRNAs的直接作用是真人投注后产生的,例如miR-200 c对EGF信号的抑制,图中分别显示miR-200 c与TGFβ在EMT/MET过程中发生的基因表达变化,其发生ΔE-ΔI (真人投注后)与ΔI (真人投注)。
图B:虽然已经确定miRNAs和真人投注因子(TGFβ)之间的相互作用,但miRNA研究的一个主要焦点是通过直接作用于靶标来理解其功能。然而,EISA表明,许多对miR-200C的反应是间接的(ΔI)。为了探讨这些真人投注变化的意义,基因本体论(分子功能)分析了在MEHMLE细胞对miR-200反应和在HMGLE细胞中对TGF反应的真人投注水平上调和下调基因集。
图C:在真人投注上调的基因中,例如ZEB 1等,间质促进真人投注因子的结合位点富集在ENCODE ChIP- Seq数据集。每个条形表示单个ChIP- Seq数据集。
图D:相对于miR-200c(ΔE-ΔI)真人投注后下调的相对程度,显示了TFs介导下游真人投注变化。真人投注后被miR-200 c下调且在它们的3’端内具有miR-200 c结合位点的TFs。
图E:TF靶基因是从 ChIP- Seq数据中获取的,然然后与根据miR-200真人投注上调或下调的基因交叉引用。

四、功能显著的真人投注调控是miRNAs的一个广泛特征。

图A-B:为了研究miRNA干扰中是否与真人投注反应有关,我们对EISA进行了多个数据集的分析,发现在所检测的8个真人投注反应中,27%到73%的基因是共同的。表达ZEB 1或多个miRNAs的真人投注和真人投注后机制的相对贡献用散点图(B)( ΔE-ΔIΔI)
图C:无论这是真人投注上调基因还是下调基因,为每个选定的miRNA进行10个基因 fold enrichment。

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