科研者必带武器-pull down 真人投注平台
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-09-10
真人投注质参与各类生命现象,在行使功能的时候,真人投注质们相互联系一起工作,彼此形成了复杂的生化网络......

作为生命活动的主要承担者,真人投注质参与各类生命现象,大部分真人投注质在行使功能的时候并不是单打独斗的,真人投注质们相互联系一起工作,彼此形成了复杂的生化网络。因此,研究真人投注质的相互作用成为研究真人投注质功能和作用机制的最为重要的环节之一。真人投注-真人投注互作的各类研究真人投注平台方法层出不穷。这里,小编来浅谈下真人投注质相互作用真人投注平台中一种比较经典的实验真人投注平台- pull down 实验。
  pull down 实验又叫做真人投注质体外结合实验(binding assay in vitro),是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验真人投注平台。用固相化的、已标记的饵真人投注或标签真人投注(生物素-、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的真人投注。带标签的诱饵真人投注能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获,形成次级亲和支持物”,用于纯化与诱饵真人投注相互作用的其他真人投注。纯化产物洗脱后,经Western blot验证或LC-MS/MS,即可证明或鉴定与诱饵真人投注互作的真人投注。
  这里,小编重点介绍下应用最广泛的GST - pull down。其利用了GST(Glutathione S transferase)对GTH(Glutathione)的亲和性,将靶真人投注-GST融合真人投注亲和固化在GTH亲和树脂上,作为与目的真人投注亲和的支撑物,充当一种“诱饵真人投注”,当真人投注溶液通过层析柱或与此固相复合物混合时,可从中捕获与之相互作用的“捕获真人投注”,洗脱结合物后可通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种真人投注间的相互作用或筛选相应的目的真人投注。“诱饵真人投注”一般采用原核表达获得,“捕获真人投注”可通过细胞裂解物、纯化的真人投注、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
实验流程:


应用:通过GST融合真人投注pull-down真人投注平台一是鉴定能与已知融合真人投注相互作用的未知真人投注质;二是鉴定两个已知真人投注质之间是否存在相互作用。
高准确性,高灵敏度。适合中度复杂的真人投注质样品,如相互作用的真人投注质条带和洗脱液; 
Tips:
  1.若要验证某真人投注X与诱饵真人投注的相互作用,可将真人投注复合物与X真人投注的抗体孵育,做Western blot验证即可;如要寻找诱饵真人投注可能的互作真人投注,则需将真人投注复合物做LC-MS/MS鉴定。
  2.高纯度的GST融合真人投注能够减少实验的假阳性。为了能够最大程度的保证融合真人投注原有的生物学活性,一般在获取融合真人投注时倾向于获取可溶性融合真人投注。(获得条件主要有:载体的选择、可溶性真人投注表达条件的选择、诱导温度、诱导时间、诱导物的浓度)
  3.内源性真人投注的干扰使得实验出现的假阳性结果较多。关于实验设计,需要严谨,对照的设计,实验重现性,bait-prey 的互换等等都需要在做实验之前认真探讨和考虑。
  4. 实验一般用于体外转录或翻译体系,如酵母双杂交系统中检测真人投注质之间的相互作用。但并不一定能真实的反应真人投注质之间的相互作用,因为在体内它们不一定空间上有碰到,所以并不意味着在生理条件下一定结合。
  Pull down真人投注平台研究真人投注互作的方法不仅强大,而且高效快速,操作简便,可直接检测是否具有相互作用。这项实验真人投注平台有利有弊,但不可否认的是,它一定是科研者必带武器,权衡使用一定能帮助大家的科研之路越来越顺利。

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