揭秘一种新的参与白血病调控的LncRNA
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-08-29
9号染色体和22号染色体相互易位产生嵌合的Bcr-Abl癌基因,该基因与几种血液病有关......

      LncRNAs是一类长度大于200 nt不编码蛋白质的核苷酸,已经被发现在多种人类疾病中均有异常表达,包括癌症。9号染色体和22号染色体相互易位产生嵌合的Bcr-Abl癌基因,该基因与几种血液病有关。然而,LncRNAs的异常表达与Bcr-Abl介导的白血病之间的相关性功能仍不清楚。
      今年,Xuefei Wang等人在Mol Cancer发表一篇 “Novel lncRNA-IUR suppresses Bcr-Abl-induced tumorigenesis through regulation of STAT5-CD71 pathway”的SCI文章,该研究旨在综合评价经伊马替尼 (Imatinib)处理的人K562白血病细胞中LncRNAs的表达情况。
技术路线:

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一、鉴定伊马替尼处理白血病细胞后上调的lncRNAs

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利用lncRNA cDNA芯片分析在K562细胞中表达的LncRNAs,图A表示伊马替尼处理或不处理组,差异表达的LncRNAs聚类分析,987个上调LncRNA,1479个下调LncRNA。图B表示伊马替尼处理后显著上调的一个LncRNA 家族(Imatinib -upregated LncRNA,简称为lncRNA-IUR),该LncRNA 家族有多个转录本,人来源的有8个转录本,鼠来源的有5个转录本。图C表示qPCR证明在K562白血病细胞中伊马替尼处理组相对于对照组lncRNA-IUR表达上调,lncRNA-IUR-5,6,8的表达具有显著性差异。图D表示qPCR证明在v-Abl转化的真人投注NS2细胞株中伊马替尼处理组相对于对照组lncRNA-IUR表达上调,lncRNA-IUR-4,5,6,8观察到类似的的表达具有显著性差异,与图C结果一致。图E和F表示从蛋白水平与RNA水平,BCR-Abl阳性患者外周血淋巴细胞lncRNA-IUR的表达显著低于正常人外周血淋巴细胞。上述结果表明,在Abl转化的白血病细胞中lncRNA-IUR的表达受到抑制,然而伊马替尼可诱导lncRNA-IUR表达.
此外,通过软件预测和实验分析lncRNA-IUR的编码潜力.进一步运用the Open Reading Frame (ORF) Finder,发现lncRNA-IUR每个转录本的ORF总长度小于300 bp。在UniProtKB/ swissprot(Swissprot)数据库中也没有预测到lncRNA-IUR的匹配肽。此外,运用Coding Potential Calculator (CPC)软件评估lncRNA-IUR家族是否具备编码能力,图G表示每个转录本的CPC评分为负,表明lncRNA-IUR家族“非编码”。图I表示在体外翻译实验中,我们能够观察对照基因KU70的蛋白带(约70kD),但未能检测lncRNA-IUR-5、6或8的任何蛋白条带。为了进一步证明lncRNA-IUR没有编码能力,通过RACE试验鉴定了一段全长的lncRNA-IUR-5(2342 nt)。
二、lncRNA-IUR影响abl转化细胞存活及体内肿瘤生长

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我们研究了在异种移植真人投注模型中,为了证明lncRNA-IUR是否对细胞存活和肿瘤形成有影响,运用shRNAs生成了lncRNA-IUR (sh- IUR -5,-6和-8)的K 562细胞株或荧光素以及显示荧光的对照细胞,图A表示lncRNA-IUR (sh- IUR -5,-6和-8)的K 562细胞lncRNA-IUR的表达相对于对照组明显降低,表明敲减成功。图B表示Imatinib浓度越高,K562细胞的生存率降低,lncRNA-IUR抑制细胞生存。图C和D表示采用异种移植真人投注模型,每只真人投注皮下接种表达shlncRNA-IUR的K562细胞,敲减lncRNA-IUR-5,6,8基因显著促进肿瘤生长。在V-ABL-转化的NS2细胞系,并使用SH- IUR -M45678敲减真人投注lncRNA-IUR-5,图F表示在NS2细胞中,敲减shlncRNA-IUR促进了细胞的存活。此外,图G表示sh- IUR--m45678的NS2细胞所形成的肿瘤比对照组大得多。实时定量PCR也证实了sh- IUR--m45678组相对于对照组 INcRNA-IUR在肿瘤中的表达下调。这些结果表明,无论在K562细胞还是在异种移植真人投注模型中,敲减INcRNA-IUR促进Abl转化的白血病细胞的存活和肿瘤的生长。

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与上述结果一致,只是一种运用敲减INcRNA-IUR的方法,一种运用过表达INcRNA-IUR的方法,在异种移植真人投注模型中,过表达INcRNA-IUR抑制Abl转化的白血病细胞的存活和肿瘤的生长。
三、在体内敲减鼠LncRNA-IUR促进ABL介导的骨髓细胞转化和白血病细胞的生长

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A、LncRNA-IUR- KD转基因真人投注及WT真人投注的照片。B、RT-PCR检测LncRNA-IUR- KD转基因及WT真人投注中肺、脾、肝、胸腺和骨髓器官LncRNA-IUR -M5的表达.C、WT和KD真人投注中Bcr-Abl转化BMC细胞的存活克隆数,KD真人投注的转化效率显著高于野生型真人投注。D、通过注射表达sh- IUR -m45678,sh-luc的GFP阳性NS2细胞来建立白血病移植真人投注模型,三组分别标记为SH-Iur-M45678组、SH-Luc组和阴性对照组。E、白血病移植后8天后,生物发光成像显示稳定表SH-Iur-M45678或SH-Luc的GFP阳性NS2细胞在WT真人投注体内分布。F、流式细胞实验检测真人投注白血病移植后第6与第9天外周血单个核细胞的变化。这些结果表示敲减鼠LncRNA-IUR促进体内ABL介导的骨髓细胞(BMC)转化和NS2细胞的生长。
四、转基因真人投注沉默LncRNA-Iur为Abl介导的白血病的发生发展提供了理想的微环境。

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A、建立KD和WT真人投注白血病移植模型, LncRNA-Iur-KD与WT真人投注在辐射后通过尾部静脉注入GFP阳性NS2细胞或等体积的PBS,实验组标记为NS2KD和NS2WT,对照组为PBS-KD和PBS-WT。 B、显示NS2-KD和NS2-WT真人投注在体内白血病移植后的第8天的代表性照片。C和D分别表示有缺陷的老鼠的体重(C)和存活率(D),每组真人投注8-10只。对真人投注进行为期15天的监测。E、生物发光成像实验观察GFP阳性NS2细胞在真人投注体内的分布情况.F、流式细胞实验检测真人投注外周血单个核细胞中GFP阳性NS2细胞的百分率。三个独立实验,选择代表性的图像。G、HE染色真人投注脾脏。
五、LncRNA-IUR-5负调节STAT5介导的CD71表达

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A、LncRNA-IUR-5敲除k562细胞系和对照细胞的转录组RNA测序分析。箭头表示CD71蛋白的三种亚型。B、 Western blot分析LncRNA-IUR-5基因敲除或过表达K562细胞株CD71 蛋白的表达水平。C-E 、Westernblotting证明分别用伊马替尼(C)、STAT5-In-1(50μM,6h)(D)或sh-STAT 5(E)敲除STAT 5来处理细胞,CD71 、P-STAT 5与STAT 5蛋白的表达水平。F、Western blot和RT-PCR检测CD71 、P-STAT 5与STAT 5蛋白和LncRNA-IUR-5的表达水平。G、从稳定表达LncRNA-IUR -S1、Iur-5或Iur-5的K 562细胞株中提取与LncRNA-IUR-5结合的蛋白。H、通过RIP验证LncRNA-IUR-5与STAT5的相互作用。lncRNA-BGL3和gapdh2为阴性对照。I和J、qPCR检测在STAT5-IN-1处理后或敲减K562细胞中lncRNA-IUR的表达。

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