敲黑板:circRNA在膀胱癌中研究新进展
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-08-13
circRNA在癌症中的应用也逐渐成为科研热点,但是研究大多数集中在胃癌、肺癌等癌症中,circRNA在膀胱癌中的真人投注模式和机制研究较少......

      环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类具有闭合环状结构的非编码RNA,它所具有的高稳定性、物种间的高保守性以及组织特异性等特点,已被研究者视为有望成为临床诊断、治疗及预后等新的分子生物标志物及靶向治疗靶点。circRNA在癌症中的应用也逐渐成为科研热点,但是研究大多数集中在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等癌症中,circRNA在膀胱癌中的真人投注模式和机制研究较少。今天,小编来给大家分享一篇最新发表在Molecular Cancer 上面的一篇关于circRNA在膀胱癌中的作用研究的文章。

      这里讲述了circRNA作为竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA, ceRNA)机制来发挥作用的研究思路,这也是目前报道最多的circRNA经典作用机制。
文章技术路线:

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研究成果:
1.筛选出这个circ在膀胱癌中显著下调并进行了相关验证
      筛选circRNA:根据以前的测序结果,发现下调基因比较多,挑选出下调基因的前五名,用20对配对的癌组织和癌旁组织进行Q-P验证,发现circSLC8A1下调最显著。一代测序鉴定出,circSLC8A1是SLC8A1基因的外显子1环化形成的。在70对膀胱癌组织和正常膀胱组织中检测circSLC8A1的真人投注,发现在癌组织中显著下调,并且样本中80%样本组织中circSLC8A1的真人投注是降低的;另外,与正常的膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1相比较,circSLC8A1在六个肿瘤细胞系中都是低真人投注。之后,设计引物鉴定SLC8A1 circSLC8A1,用5637、T24细胞的cDNA和基因组DNA(Gdna)做模板进行扩增,发现circSLC8A1仅在以外扩引物扩增cDNA中能检测到,经过Q-P也能确定circSLC8A1对RNA酶耐受


2. circSLC8A1的过真人投注能抑制肿瘤细胞迁移侵袭(功能实验)
      5637和T24细胞过真人投注circSLC8A1,同时SLC8A1 mRNA真人投注不受影响,划痕实验、transwell证明circSLC8A1过真人投注能显著抑制肿瘤细胞迁移侵袭。之后通过小RNA降低circSLC8A1真人投注,但不影响SLC8A1 mRNA真人投注,同样实验发现细胞迁移侵袭能力增加


3.验证完circSLC8A1的真人投注模式和功能开始寻找作用机制:先验证公认的海绵作用
      根据circSLC8A1的海绵作用寻找相关的miRNA,通过三种公开的预测工具选出7个候选miRNA,在两种肿瘤细胞一株永生化细胞中通过pull-down实验验证他们与circSLC8A1是否直接相关。结果显示miR-130b和miR-494是在3个肿瘤细胞系中都能被circSLC8A1拉下来的miRNA。用miRNA mimics进一步验证两者的直接联系,结果显示mimics能捕捉更多的circSLC8A1。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验验证了circSLC8A1和两个miRNA都是在细胞质中。以上三个实验结果都证明了circSLC8A1能直接绑定miR-130b和miR-494


4.检测miR-130b和miR-494在膀胱癌中的作用
      Q-P结果显示2个miRNA在肿瘤组织上调,相关性分析显示circSLC8A1与MiRNA是负相关。之后检测2个miRNA过真人投注后对细胞功能的影响:CCK-8检测细胞miRNA过真人投注显著促进细胞增殖,transwell显示过真人投注能促进细胞迁移侵袭,若抑制miRNA则抑制细胞迁移侵袭。有研究显示miRNA能通过序列识别进行mRNA的转录后调控,通过软件预测发现这2个miRNA能绑定PTEN的3′-UTR,荧光素酶报告基因实验显示过真人投注2个miRNA能显著降低PTEN真人投注,同时进行WB验证。Figure4主要检测两个miRNA的功能,并且筛选出其下游靶基因。以上只是找到了膀胱癌密切相关的circSLC8A1,并且找到与circSLC8A1有直接关系的miRNA及其下游靶基因,也验证了miRNA在膀胱癌中的作用


5. 探究circSLC8A1能否通过调控miRNA进而调控PTEN真人投注、抑制肿瘤进展
      在肿瘤细胞内共转染这circSLC8A1和两个miRNA,cck-8和transwell检测发现circSLC8A1过真人投注抑制细胞迁移侵袭增殖能力,但当miRNA也过真人投注后就很大程度上消弱circSLC8A1的抑制迁移侵袭增殖能力。并且,发现相对于只过真人投注circSLC8A1,共转染circSLC8A1和miRNA能显著降低PTEN的真人投注。之后在10对乳腺癌组织和正常癌旁癌症检测PTEN的真人投注, 发现癌组织中PTEN真人投注降低。以上得出结论circSLC8A1能充当miRNA海绵进而调控PTEN真人投注


6.体内功能实验
      T24细胞稳定转染circSLC8A1,注射到BALB/c裸鼠皮下,之后每周测量长出来的肿瘤体积,发现与对照相比,过真人投注circSLC8A1的一组肿瘤生长速度慢,肿瘤重量都显著减小,并且发现过真人投注circSLC8A1的肿瘤组织中circSLC8A1真人投注显著上调,miR-130b和miR494真人投注显著下调,免疫组化结果显示PTEN真人投注升高。再次验证了三者之间有紧密联系
   已知PTEN是PI3K/AKT信号通路的负调节因子,而MMP-9蛋白是肿瘤迁移的关键因子,它能被这个信号通路调控,所以免疫组化结果又检测了AKT,P-AKT,MMP-9的真人投注,发现circSLC8A1过真人投注能抑制AKT,P-AKT、MMP-9的真人投注,发现都是真人投注降低体内实验证明circSLC8A1能调控PTEN真人投注抑制癌症进展


总结:
  1.找到靶点并发现circSLC8A1在膀胱癌中有作用
  2.探究circSLC8A1作用机制: circSLC8A1/miRNA-130b,miRNA-494/PTEN轴

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