肝癌转移的引路人——lncRNA 真人投注平台
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-07-31
关于肿瘤转移转移的驱动分子仍有许多未知之处。在此,我们的目的是鉴定出对人类肝癌(HCC)的转移至关重要的长链非编码RNA(lncRNA)......

  关于lncRNA与癌症之间的研究是近年来的热点,对于常见的癌症如肝癌、胃癌等,研究者们投入了大量的时间和精力,研究其生长、转移,侵袭的机制,以期找到治愈它们的有效办法。今天小编就给大家带来了今年三月,Dr. Liang Yang等人在杂志《Theranostics》上发表的题为“LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma metastasis by stimulating ITGAV transcription”的一篇文章,IF=8.063。 文章介绍了作者如何一步步证明lncRNA 真人投注平台通过诱导ITGAV转录的染色质修饰作为先导因子促进HCC转移的,同时指出lncRNA 真人投注平台是HCC患者转移或预后不良的潜在分子标志,这对HCC的治疗有着重要的临床意义。
实验结果:
1.LncRNA 真人投注平台927503在HCC细胞中高真人投注平台     
  研究者使用ArrayStar lncRNA芯片V2.0比较硫脂处理的HCC细胞和对照细胞的lncRNA图谱,观察到了一组全面的差异真人投注平台的lncRNA。
  在53对肝癌和邻近的非肿瘤(NT)标本队列中,肝癌组织的真人投注平台真人投注平台明显高于癌旁NT组织(P<0.001,图1A,a&b)。在另一组80例HCC患者中,原位杂交分析显示HCC组织中每个细胞的真人投注平台信号明显高于邻近NT组织(P<0.01,图1B,a)。与T1和T2期患者相比,T3和T4期HCC患者的真人投注平台信号增加(P<0.05,图1B,b)。随访患者(n=64)的生存分析显示,低真人投注平台真人投注平台的患者比高真人投注平台真人投注平台的患者存活时间长(P=0.034,图1B,c&d)。肿瘤大小(>3 cm)的患者真人投注平台水平高于小肿瘤患者(P<0.05,图1B,e)。有血管肿瘤栓阻的患者真人投注平台水平高于无肿瘤栓阻的患者(P<0.05,图1B,f)。分析来自肿瘤基因组图谱(TCGA)肝癌数据库的数据可以得出,肝癌组织与其配对NT组织相比,真人投注平台真人投注平台升高(P<0.001,N=248,图1C,a)。Kaplan-Meier生存分析显示,高真人投注平台水平与肝癌患者的总生存率差密切相关(N=180,P=0.0014,图1C,b)。真人投注平台在乳腺(N=837)、肾脏(N=448)、肺(N=488)和肝组织中广泛真人投注平台,真人投注平台在肿瘤中的真人投注平台高于正常组织(图1D)。真人投注平台在MHCC97H(高转移潜能)HCC细胞中的真人投注平台明显高于MHCC97L(低转移潜能)HCC细胞(P<0.05,图1E,a)。

说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F1.tif

2.真人投注平台促进ITGAV真人投注平台     
  已证明硫脂通过整合素αVβ3上调ITGAV促进肝癌的转移。分析7种肝癌细胞株和人肝细胞LO2细胞株中真人投注平台和ITGAV的真人投注平台水平。真人投注平台在Hep3B、HepG2、LM3、SMMC-7721、Huh7、LO2、BEL-7404和SK-Hep1细胞中的真人投注平台谱与ITGAV相似,可发现真人投注平台和ITGAV真人投注平台水平之间存在密切的正相关(皮尔逊相关系数r=0.8729,图1E,b-d)。分析53例HCC患者组织标本中真人投注平台和ITGAV mRNA的真人投注平台水平,53例HCC组织中有36例显示真人投注平台水平明显高于邻近NT组织(P<0.01,图1A,c)。在36个样本中,33个也真人投注平台高水平的ITGAV。17个HCC样本中有5个真人投注平台水平低于邻近NT组织,ITGAV水平也较低(图1A,d)。皮尔逊卡方(χ2)检验结果显示,真人投注平台和ITGAVmRNA真人投注平台水平之间存在显著相关性(P<0.0 5)。TCGA数据分析显示真人投注平台和ITGAV真人投注平台水平密切相关(N=122,P<0.0001,图1C,c)。在过度真人投注平台真人投注平台的HCC细胞中,ITGAV mRNA水平几乎增加了两倍,但敲除真人投注平台使ITGAV mRNA水平急剧降低(图2A)。在过度真人投注平台真人投注平台的HCC细胞中,ITGAV蛋白水平也增强,并且与对照细胞相比,真人投注平台敲除细胞中的ITGAV蛋白水平显着降低(图2B)。免疫荧光分析显示,在过度真人投注平台真人投注平台的肝癌细胞中,ITGAV和整合素αVβ3在细胞表面的真人投注平台明显增加,而在真人投注平台敲除细胞中则下降(图2C)。
说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F2.tif

3.真人投注平台促进肝癌细胞的转移相关行为     
  血管生成是肿瘤转移的重要因素,与整合素αVβ3相关,研究者进行管腔形成实验来研究真人投注平台在血管生成中的作用。过真人投注平台真人投注平台的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)显示明显多于模拟细胞的分支点(血管生成的指标)(P<0.01,图3A)。敲除ITGAV可消除真人投注平台在HUVECs中的血管生成作用且使分支点减少到低于对照组的数目。ITGAV的过真人投注平台能恢复HUVECs的分枝能力。在转染真人投注平台的细胞中形成的菌落数量明显多于模拟细胞。与扰乱对照相比,沉默真人投注平台的细胞中的菌落数量明显减少(图3B,a)。真人投注平台的过真人投注平台显著增加了细胞活力(图3B,b),敲除ITGAV消除这种真人投注平台效应。在Hep3B细胞中,敲除真人投注平台显著降低了细胞活力,转染ITGAV或真人投注平台构建挽救了细胞活力(图3B,b)。
  EMT是HCC中使肿瘤细胞迁移和转移的重要过程。真人投注平台显著降低E-cadherin的真人投注平台水平,并提高N-cadherin、ZEB1或Twist的水平(图3C,a&b)。这些真人投注平台效应被ITGAV敲低所消除。相反,敲除真人投注平台促进E-cadherin,但抑制N-cadherin,vientin,ZEB1和Twist真人投注平台,ITGAV过真人投注平台逆转了这一效应(图3C,a&b)。真人投注平台的过真人投注平台增强了干细胞标志物OCT4和SOX2的真人投注平台,这种效应被ITGAV敲低所消除(图3d,a&b)。真人投注平台沉默则情况相反。2μM 5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的细胞与对照细胞相比,真人投注平台真人投注平台明显降低(P<0.0 1,图3E,a&b);与模拟组相比,2μM 5-FU处理的细胞活力因真人投注平台的过真人投注平台而显著增强,因ITGAV的沉默而降低(图3e,c)。真人投注平台敲除显著抑制了5-FU处理的Hep3B细胞的细胞活力,但真人投注平台或ITGAV的过真人投注平台在48小时后完全恢复了细胞活力(图3E,d)。过量真人投注平台真人投注平台的HepG2细胞的5-FU半数抑制浓度(IC50)明显高于对照细胞。 敲除真人投注平台可显著降低5-FU在Hep3B细胞中的IC50(图3E,e&f)。

说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F3.tif

说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F3-2.tif

4.真人投注平台促进HCC转移     
  利用肿瘤异种移植,研究lncRNA 真人投注平台在体内对肿瘤生长和转移的影响。基于真人投注平台和ITGAV水平,选择稳定的真人投注平台过真人投注平台(真人投注平台4)和对照(M6)细胞进行肿瘤异种移植实验(图4A)。将真人投注平台4或M6细胞(5×106细胞)皮下注射给4周龄雌性BALB/c裸鼠(n=10/组),观察肿瘤大小,发现真人投注平台组的肿瘤明显大于对照组(图4B)。真人投注平台组的真人投注平台和ITGAVmRNA水平高于对照组,并且ITGAV和整合素αVβ3(图4C,a和b)的染色比对照组强。真人投注平台组肿瘤组织阳性CD31(血管内皮细胞标记物)染色高于对照组(图4D,a)。在真人投注平台组的Matrigel-plug中也观察到比对照组更多的CD31阳性细胞(图4D,b)。真人投注平台组肝和肺转移灶也明显多于对照组(图4E)。在真人投注平台组肝转移组织中ITGAV染色比对照组更强烈(图4F)。
说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F4.tif

5.真人投注平台增强ITGAV基因转录     
  在HCC细胞中进行原位杂交分析,观察到真人投注平台定位在细胞核或细胞质中(图5A,a)。通过RNA纯化(Chirp)分离染色质的实验,以使用生物素化的真人投注平台来拉低超声剪切的基因组DNA,发现ITGAV启动子是真人投注平台复合体的一部分(图5B),这表明真人投注平台与ITGAV启动子相互作用。使用全长ITGAV启动子(-1295至+207)进行荧光素酶报告分析,以研究真人投注平台对ITGAV启动子活性的影响(图5A,b)。真人投注平台过真人投注平台显著刺激了SMMC7721(P<0.001),HEK293T(P<0.001)和HeLa(P<0.001)细胞的ITGAV启动子活性(图5A,c),这些细胞中的真人投注平台敲除显著降低了ITGAV启动子的活性(图5A,d)。全长真人投注平台不增强酪氨酸羟化酶(TH)或pGL3启动子活性(图5C,d),这表明真人投注平台特异性调节ITGAV启动子活性。
  真人投注平台结构域缺失实验(图5D)发现突变体5(1-671)和4(1-522)显示增强的ITGAV启动子活性,类似于全长真人投注平台(图5C,a&b),但突变体2(1−371)和1(1−298)在HEK293T和SMC-7721细胞中均未显示出增强的ITGAV启动子活性。突变体3(1−401)表现出部分刺激效应。这些结果表明,真人投注平台的371-522结构域对于真人投注平台对ITGAV启动子活性的调控具有重要作用。突变体真人投注平台Δ371-522缺乏371-522结构域,没有显示真人投注平台诱导的ITGAV启动子活性(图5C,c)。单独过真人投注平台真人投注平台的371-522片段或真人投注平台∆371-522 序列均不能刺激 ITGAV启动子的活性和转录。只有当全长真人投注平台过真人投注平台时,才在BEL-7404和SMMC-7721细胞中检测到ITGAV的真人投注平台(图5E,a&b)。ITGAV蛋白真人投注平台也观察到类似的结果(图5E,c)。此外,无论是真人投注平台∆371-522还是真人投注平台371-522都不能单独促进伤口闭合率(图5E,d)。

说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F5.tif

6.真人投注平台与链接蛋白H1FX相互作用      
  RNA免疫沉淀(RIP)和RNA下拉分析显示真人投注平台与已知对ITGAV真人投注平台重要的因素(8,9,21)之间没有显著的相互作用。在这两种方法中,没有发现真人投注平台与ZNF282的相互作用(数据未显示)。通过质谱和高通量蛋白质芯片实验,筛选与真人投注平台相关的蛋白质。通过质谱和蛋白芯片分析鉴定组蛋白1FX(H1FX)和Ig kappa链C区(IGKC)。IGKC被排除在进一步的分析之外。RNA下拉试验显示真人投注平台和H1FX之间存在直接相互作用(图6A,a)。在由奇数或偶数真人投注平台探针池拉下的复合体中也观察到H1FX(图5B)。在其他六个组蛋白H1变异体中,H1.2、H1.3和H1.4与真人投注平台在复合物中沉淀,但H1.0、H1.1和H1.5没有(图6A,a)。H1FX、H1.2、H1.3和H1.4也与真人投注平台371−522结构域相互作用(图6A,b)。在真人投注平台缺失突变体真人投注平台∆371−522中,共沉淀复合体中H1FX水平明显降低,但与包含全长真人投注平台的沉淀相比,H1.2,H1.3或H1.4水平保持不变。结果表明真人投注平台(371−522)的中心结构域与H1FX相互作用。
说明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA 真人投注平台 promotes hepatocellular carcinoma\F6.tif

7.真人投注平台与H1FX结合诱导染色质重构     
  使用五对引物通过染色质免疫沉淀分析测试了ITGAV启动子的H1FX占有率(图6B,a)。H1FX不仅在-1241到-677之间占据了ITGAV启动子区域(图6B,b),而且在内含子1和外显子1和2上也被观察到。
  RNA聚合酶II(Pol 11)占据了内含子1和上游区域从-894到-492(图6B,d)。Ay过真人投注平台显著增加了pol II在上游区域的占有率,但内含子1和上游区域从-894到-492的H1FX占有率显著降低(图6B,c&e)。启动子上H3K27me3(一种含有三甲基化赖氨酸27残基的组蛋白H3)占有率降低(图6C)。真人投注平台显著增强了ITGAV启动子上H3K4me3和acH3K9/14的占有率(图6C)。H1FX沉默消除了真人投注平台过真人投注平台对ITGAV启动子的刺激(图6D,a)。H1.2,H1.3或H1.4的沉默对ITGAV的真人投注平台没有任何影响,由于真人投注平台过真人投注平台,它们在ITGAV启动子上的占有率没有改变(图6D,a&b)。这些结果表明真人投注平台与H1FX相互作用诱导ITGAV启动子上的核心组蛋白修饰。
8.真人投注平台诱导的核心组蛋白修饰排斥H1FX结合
  连接组蛋白与DNA/核小体的结合是由组蛋白伴侣蛋白实现的。通过质谱,发现组蛋白1伴侣核仁蛋白(NCL)是真人投注平台复合物的一部分。核糖核酸下拉试验显示NCL与全长真人投注平台和突变的真人投注平台(真人投注平台371-522,真人投注平台∆371-522)相互作用(图6A)。真人投注平台的过真人投注平台显著降低了ITGAV启动子上NCL的富集(从-894到-492)(图6D,b)。NCL的沉默也减弱了真人投注平台对ITGAV转录的刺激作用(图6D,a)。真人投注平台的异位真人投注平台显著增强了组蛋白乙酰基转移酶PCAF(acH3K9/14的组蛋白乙酰基转移酶)的占有率,但减少了组蛋白去乙酰化酶SIRT1在ITGAV启动子区域-894到-677的富集(图6e)。来自芯片序列的数据确实表明SIRT1和PCAF被结合在ITGAV位点上(图6F)。结果表明,真人投注平台招募组蛋白修饰酶并诱导区域组蛋白修饰,从而排斥NCL/H1FX结合并激活ITGAV启动子。

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