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栏目:最新研究动态 发布时间:2018-08-09
CircRNAs是一类广泛真人投注平台在哺乳动物细胞中的非编码RNA。全基因组分析揭示了环状RNA的跨物种分布......

CircRNAs是一类广泛真人投注平台在哺乳动物细胞中的非编码RNA。全基因组分析揭示了环状RNA的跨物种分布,并且其特性是进化性保守的,这便进一步揭示了环状 RNA的特定的生理角色与功能。鉴于此,加拿大多伦多大学杨柏华教授带领他的团队探究了circ-Dnmt1对乳腺癌的作用,并于2018年7月4日在Oncogene杂志(IF=7.5)发表了他们的研究成果,环形RNA circ-Dnmt1 通过调控p53和AUF1入核,促进细胞自噬作用。Circ-Dnmt1是DNMT1基因第6和7外显子反向拼接形成的,作者是通过芯片分析发现乳腺癌细胞中普遍存在circ-Dnmt1高真人投注平台的现象,因此针对该分子的作用机制展开了研究。过真人投注平台circ-Dnmt1能促进细胞增殖,并且能增加对应的Dnmt1的成熟的mRNA水平,但对该基因的转录出产物pre-mRNA没有影响。过真人投注平台circ-Dnmt1能促进细胞自噬,免疫荧光实验表明p53和AUF1在circ-Dnmt1过真人投注平台后核定位增加了,RIP实验证明了circ-Dnmt1可以与p53和AUF1相互作用。核定位的p53促进自噬相关基因的真人投注平台,而核定位的AUF1不能继续调控Dnmt1的mRNA降解作用,导致该mRNA富集并促进DNMT1蛋白的真人投注平台。小鼠皮下肿瘤模型实验表明过真人投注平台circ-Dnmt1显著增加肿瘤的体积。

技术路线

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结果
1. circ-Dnmt1在乳腺癌中高真人投注平台  

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图1. 乳腺癌细胞中存在circ-Dnmt1过真人投注平台。

(a-c)通过芯片筛选,比较乳腺癌细胞与非癌乳腺细胞中circRNA的真人投注平台水平,发现了circ-Dnmt1在所有乳腺癌细胞中均有高真人投注平台。d. circ-Dnmt1在基因组的位置及过真人投注平台载体的构建构建。e. 验证了相关引物的特异性。f. Northern实验证明了circ-Dnmt1在细胞内的内源真人投注平台。g. circ-Dnmt1对MCF-7细胞增殖的影响。

2. circ-Dnmt1促进细胞自噬

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图2. MCF-7细胞中过真人投注平台circ-Dnmt1可促进细胞增殖。

(ab). 过真人投注平台circ-Dnmt1后细胞衰老的比例明显下降(β-gal染色阳性率低),LC3B明显增多。c. 几种自噬抑制剂处理后circ-Dnmt1真人投注平台会增加,这些抑制剂包括:SP600125、Chloroquine、LY294002、Wartmannin。d. 这些抑制剂的处理可阻止过真人投注平台circ-Dnmt1导致的细胞增殖和衰老相关的表型。(e-g)过真人投注平台circ-Dnmt1后,母基因Dnmt1的mRNA水平增加,但该基因转录初产物pre-mRNA(基于内含子序列的引物)并没有增加,说明不是通过促进该基因的转录水平的作用。(hi)干扰circ-Dnmt1后Dnmt1和LC3B的真人投注平台降低,增加了细胞衰老。

3 circ-Dnmt1促进p53和AUF1入核

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图3. circ-Dnmt1促进p53和AUF1入核。

a. circ-Dnmt1转染细胞能够提高Dnmt1和LC3B的真人投注平台。b. circ-Dnmt1转染细胞后,能够提高circ-Dnmt1在胞核和胞质中的真人投注平台水平。c. circ-Dnmt1转染细胞后,降低p53的真人投注平台和提高肿瘤形成。d. circ-Dnmt1转染细胞后,能够降低胞质中的p53的真人投注平台,提高胞核中p53的真人投注平台。不影响Auf1的总体真人投注平台,但是降低胞质中的Auf1的真人投注平台,提高胞核中Auf1的真人投注平台。e. 沉默circ-Dnmt1后能够降低p53和Auf1的核转录。

4 细胞自噬能够提高circ-Dnmt1、p53和AUF1入核

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图4. 细胞自噬与circ-Dnmt1真人投注平台水平和核定位有关。

(a-h)EBSS 和Rapamycin诱导的细胞自噬条件下,p53和AUF1也会入核,但干扰circ-Dnmt1后,这一入核现象消失。这些自噬诱导剂还可以促进Dnmt1和LC3B蛋白水平的增加。i. 过真人投注平台circ-Dnmt1后,circ-Dnmt1的核定位也增加。

5 circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用  

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图5. circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用。

基于抗p53和AUF1的抗体RIP实验证明,确实存在circ-Dnmt1于两种蛋白的相互作用。计算机模拟实验也佐证了这一相互作用现象。

6 计算机模拟证明circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用 

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图6 circ-Dnmt1可与p53和AUF1相互作用位点验证。

基于计算机模拟的结果,作者设计了突变载体和反义核苷酸片段,验证是否可阻断circ-Dnmt1与p53和AUF1的相互作用。突变和反义核苷酸均明显抵消了过真人投注平台circ-Dnmt1后细胞的影响,包括增殖能力和衰老表型等。p53和AUF1的核定位也受到了影响,说明所预测的位点的确是circ-Dnmt1与p53和AUF1相互作用的位点。

 

至此,circ-Dnmt1在乳腺癌细胞中的作用机制已成型:高真人投注平台的circ-Dnmt1分子通过与p53和AUF1相互作用,最终三种分子均发生入核转移,入核后的p53促进细胞自噬相关的基因真人投注平台,入核后的AUF1蛋白不再具有抑制Dnmt1 mRNA的功能,因此促进了Dnmt1蛋白的翻译积累,抑制了p53的转录并促进了肿瘤增殖有关的基因真人投注平台。

7 过真人投注平台circ-Dnmt1促进肿瘤生长速度

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图7体内分析circ-Dnmt1的功能。

皮下肿瘤模型表明过真人投注平台circ-Dnmt1后肿瘤的生长速度明显增加。自噬诱导剂也可以有类似的作用,而自噬抑制剂则阻止过真人投注平台circ-Dnmt1对肿瘤生长的影响。


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